Magnetic Resonance Elastography Metodikk for vurdering av Tissue Engineered Construct Vekst

Summary

Prosedyren viser metodikken av magnetisk resonans elastography for å overvåke konstruert utfallet av fettvev og osteogenic vev konstruerte konstruerer gjennom noninvasive lokal vurdering av mekaniske egenskaper ved hjelp av mikroskopiske magnetisk resonans elastography (μMRE).

Abstract

Tradisjonell mekanisk testing resulterer ofte i ødeleggelsen av prøven, og i tilfelle av langsiktige vev konstruert konstruere studier, er bruk av ødeleggende vurdering ikke akseptabelt. Et foreslått alternativ er bruk av en avbildning prosess som kalles magnetisk resonans elastography. Elastography er en ikke-destruktiv metode for å avgjøre hvilken konstruert utfallet ved å måle lokale mekaniske egenskapsverdier (dvs. kompleks Skjærmodul), som er essensielle markører for å identifisere strukturen og funksjonaliteten til en vev. Som en noninvasive middel for evaluering, har overvåking av konstruerte konstruksjoner med bildediagnostikk som magnetisk resonans imaging (MRI) sett en økende interesse i det siste tiåret ^en. For eksempel har magnetisk resonans (MR) teknikker for diffusjon og relaxometry kunnet karakterisere endringer i kjemiske og fysiske egenskaper ved konstruerte vev utvikling ^to. Metoden foreslått ifølgende protokollen bruker mikroskopiske magnetisk resonans elastography (μMRE) som en ikke-invasiv MR-basert teknikk for å måle de mekaniske egenskapene til små myke vev ^3. MRE oppnås ved å koble en sonisk mekanisk aktuator med vev av interesse og registrere shear bølgeutbredelse med en MR skanner ^fire. Nylig har μMRE blitt brukt i tissue engineering å tilegne seg viktig veksten informasjon som tradisjonelt måles ved hjelp av destruktive mekaniske makroskopiske teknikker ^5. I det følgende prosedyre, er elastography oppnås gjennom avbildning av konstruerte konstruksjoner med en modifisert Hahn spin-ekko sekvens kombinert med en mekanisk aktuator. Som vist i figur 1, synkroniserer endret sekvens bilde oppkjøpet med overføring av eksterne skjærbølger, senere, er det bevegelse sensibilisert gjennom bruk av oscillerende bipolare par. Etter samling av bilder med positive og negative bevegelser sensitizasjon, kompleks divisjon av data produsere et skjær bølge bilde. Deretter blir bildet vurderes ved hjelp av en inversjon algoritme for å generere et skjær stivhet kart ^6. De resulterende målinger ved hver voxel har vist seg å korrelere sterkt (R ^2> 0,9914) med data samlet inn ved hjelp dynamisk mekanisk analyse ^7. I denne studien, er elastography integrert i vev utviklingsprosessen for å overvåke menneskelig mesenchymale stamcelle (h MSC) differensiering inn adipogenic og osteogenic konstruksjoner som vist i Figur 2.

Protocol

1. Tissue Construct Forberedelse

Vevet konstruere forberedelse prosessen består av tre hovedtrinn: utvidelse av celle befolkning, såing av celler inn på en biomateriale stillas, og differensiering gjennom bruk av kjemiske signalmolekyler. Prosedyren for konstruktet forberedelse er basert på metoder utført av Dennis et al., Hong et al., Og Marion og Mao ^8,9,10.

1. Etter kultur og utvidelse av cellelinje, frø de menneskelige stamceller (h MSCS) på en gelatin svamp (4 mm diameter, 3,5 mm tykkelse) ved en tetthet på 1x10 ⁶ celler / ml for ben og 3x10 ⁶ celler / ml for adipose formasjon.
2. For differensiering av h MSCS inn adipose, bruke adipose induksjon media bestående av en mM deksametason, 0,5 mM Isobutyl-methylxanthine, 10 mikrogram / ​​ml humant rekombinant-insulin, og 200 mM indometacin i celle ekspansjon mediumgang cellene synes konfluent på stillaset. Etter tre dager, erstatte media med 10 mikrogram / ml humant rekombinant-insulin i utvidelse media i 24 timer da tilbake til induksjon media. Gjenta syklusen tre ganger og deretter utveksle bare i vedlikehold media annenhver dag.
3. Å indusere Osteogenesis, forberede osteogenic induksjon media ved å lage en endelig konsentrasjon på 0,1 mM deksametason, 50 mikrometer av L-askorbinsyre-2phosphate, og 10 mm β-glycerophosphate i celle ekspansjon medium. Erstatt med ferske osteogenic media annenhver dag.

2. Actuator Karakterisering

Karakterisering av aktuatoren er et viktig steg for MRE eksperimentet. MRE er avhengig av utbredelsen av mekaniske skjærbølger å vurdere lokale verdier for mekaniske egenskaper, derfor disse mekaniske vibrasjoner må genereres og karakteriseres innenfor vev av interesse å bruke en piezoelektrisk aktuator. En illustrert EXAmple av karakteriseringen prosessen er vist i figur 3. Målet med denne prosedyren er å optimalisere bevegelse av aktuatoren for å generere ufarlige skjærbølger med betydelige amplituder (~ 250 micron).

1. Før forsøket, gjelder 0,5% agarose gel å vedlegge konstruktet i en 10 mm reagensrør. Temperaturen på gel bør være ca 37 ° C for å minimere skader på konstruere.
2. Rensk agarose gel fem minutter å sette i romtemperatur, setter spissen av piezoelektriske bøying motoren inn i overflaten av gel.
3. Fest glasset med prøven og aktuatoren til en skikkelig støtte, og orientere strålen av Laser Doppler Vibrometer mot tuppen av den mekaniske aktuatoren. Juster plassering av systemet for å optimalisere det reflekterte signalet, bruke reflekterende tape hvis nødvendig.
4. Basert på den forventede resonansfrekvens av den mekaniske aktuatoren, setter funksjonen generator for å feie desired frekvensområdet (dvs. 20 til 2000 Hz i dette eksperimentet) ved hjelp av en driftsspenning på 20 Vpp med en hvit støy signal.
5. Se preget spekteret på Polytec Vibrosoft program for å identifisere resonansfrekvens av systemet og sette programmet til å FFT og hastighet som y-aksen.
6. For fortrengning måling, sette aktuatoren å levere en kontinuerlig sinusoid på angitt resonansfrekvens bruker en spenning på 200 Vpp, og merk det genererte forskyvning blir levert til overflaten av gel. Sett Vibrosoft å vise FFT med forskyvning som y-aksen.

3. Image Acquisition

1. Etter endt aktuator karakterisering, plasser prøven og aktuator i midten av MR skanner. For vev Construct eksperimenter, bruk en liten og mer følsom RF spolen (dvs. 10 mm i dette eksperimentet) for overføring og mottak av RF-signal. (Prosedyren vist benytter en 9,4 Tvertikal boring magnet utstyrt med trippel aksen graderinger, 100 g / cm).
2. Erverve en speider bilde for identifisering av begrepet sted.
3. Sett parameterne for oppkjøpet. En typisk in vitro sagittal skanning vil ha en gjentagelse tid på 1000 ms, ekko tid 20-40 ms, sklie tykkelse på 0,5-1,0 mm, og synsfelt på 12x10 mm ² med en matrise størrelse på 128x128 piksler.
4. For elastography parametere, sette aktuatoren frekvensen til verdien bestemmes av Laser Doppler Vibrometer karakterisering. I denne studien ble en bipolar par trengte med en gradient amplitude på 50 g / cm. Andre parametere for å justere inkludere forsinkelsen som bør settes til null millisekunder for den første oppkjøpet.
5. Endre funksjonen generatoren til å sprekke modus og justere parametrene til funksjonen generatoren for å matche de i elastography oppkjøpet parametere inkludert frekvens og antall sykluser. Sett også funksjon generator å bli eksternt utløses.
6. For en sagittal bilde, sette bevegelse sensibilisering å være i positiv skive retning og starte skanningen. Etter oppkjøpet, sjekk bildet og endre overfølsomhet mot den negative skive retning.
7. Kjør MATLAB program som skal utføre komplekse divisjon for generering av skjær bølgen bildet.
8. Vurdere bildet for tilstedeværelsen av skjærbølger og mulige gjenstander som for eksempel fase innpakning.
9. Hvis ingen justeringer til bildet er nødvendig, justere parameter array størrelse til åtte like linjeavstand verdier fra null sekunder til en full periode preget resonansfrekvens.
10. Erverve en scan i både de positive og negative skive orientering.
11. Når bildene er kjøpt, kan du bruke en MATLAB program utviklet for å generere skjær bølge data fra en rekke bilder.

4. MRE Experiment Image Processing

1. The siste trinn av MRE er å beregne shear stivhet fra skjær bølge bildene. Plassering dataene inn i MATLAB program som vil vurdere det tredimensjonale datasettet (2 romlig, en temporal).

Merk: Ved å anta en plan skjær bølge, bevegelseslikningene frikople slik estimering av de komplekse-verdsatte skjærmodul som en funksjon av deplasement og dens Laplacian. Algoritmen tilnærmet romlige sekund derivater med begrenset forskjell og beregner Skjærmodul på en piksel-for-pixel basis. Fra denne komplekse tall, kan mange mekaniske parametere utledes eksempel skjær bølge hastighet, bølge demping, skjær stivhet, skjær elastisitet, skjær viskositet osv. Algoritmen også tillater valg av regioner av interesse der gjennomsnitt og standardavvik hver parameter beregnes.

2. De imaging parametere må spesifiseres i begynnelsen av programmet. I tillegg the øvre grense for elastogram kan justeres for å optimalisere kontrast i prøven.

Merk: Programmet gir mellomresultater (bølge etter lav-pass filter, bølge etter retningsbestemte filtrering, tidsmessige FFT, linje profiler etc.) som hjelper brukeren anslå trofasthet oppgangen.

3. Noen parametere kan justeres basert på denne informasjonen, slik som nivåene av low-pass filter, det timelige frekvensen av bevegelse, retning av spredning av bølgen osv. Standardavviket en parameter i en bestemt region av interesse er også en indikator på kvaliteten av beregningen.

5. Representative Resultater

Figur 4 notater endring i mekaniske egenskaper gjennom fire uker med osteogenic og adipogenic konstruere utvikling. MRE ble gjennomført ved 730-820 Hz. Mens begge seeded svamper startet på ca 3 kPa, osteogenic adresserte vev resulterte i en stivhet på 22 kPa, mens, adipose regissert vev sank i stivhet til 1 kPa. Videre viste de osteogenic konstruerer en merkbar nedgang i størrelse i forhold fra begynnelse til slutt av studien. Andre egenskaper avledet fra elastography studien er vist i Tabell 1.

Figur 1. Bildet anskaffelsesprosess for magnetisk resonans elastography. Under bildet oppkjøpet, kontrollerer en puls sekvens (a) synkronisering (b) av funksjonen generatoren med bipolar gradienter pulser av MR skanner. Etter oppkjøpet av bipolar gradienter slått i positive og negative orientering, (c) et skjær bølge bildet er produsert ved hjelp av kompleks divisjon.

Figur 2. Flow diagram av MRE prosessen for vev motoruoppdagede konstruksjoner. Først blir celler (a) første vokst og utvidet til befolkningen størrelsen avgjørende for utformet prosjektet. Da cellene er blir seeded (b) på en biomateriale stillas og kjemiske reagenser brukt for å signalisere differensiering. Stillasene er karakterisert med MRE, som første trinn (c) er bestemmelse av resonansfrekvensen av aktuatoren kobles til begrepet. Deretter MR-bilder (d) er anskaffet for å generere et skjær bølge bilde (e). Til slutt, er en algoritme brukes til å gi en elastogram (f) som kartlegger stivhet i konstruksjonen. Samtidig konstruerer er seksjonert for histologiske undersøkelser (g) for å validere differensiering.

Figur 3. Actuator karakterisering prosedyre. Den gelatin Stillaset er omsluttet av en 0,5% agarose gel. For å karakterisere forslaget som blir overført til prøven en hvit støy blir først sendt inn i systemet(1a) og den resulterende bevegelse er oppdaget ved hjelp av en laser Doppler Vibrometer (1b). Når resonansfrekvensen bestemmes, en kontinuerlig sinusoid signal ved resonans (2a) er sendt for å bestemme forskyvning (2b) overført til gelatin miljøet.

Figur 4. Konstruer utvikling kart over fire ukers periode. Adipogenic (A) og osteogenic (O) løysingar blir vist fra venstre mot høyre med tilsvarende størrelse og skjær bølge bilder, elastogram, og gjennomsnittlig skjær stivhet. Fargekartet for elastogram korresponderer med fargevalget på stolpediagram og feilfelt representerer standardavviket innenfor hver konstruksjon sin region av interesse.

Tabell 1. Mekaniske egenskaper for adipose og osteo konstruksjoner over en fire ukers periode med vekst.

Discussion

I denne prosedyren, er prosessen med MRE for vev konstruert konstruerer demonstrert fra celleforberedelsen til generering av en elastogram. Ved å anvende en destruktiv mekanisk vurdering metode til tissue engineering rørledningen, er det nå mulig å vurdere endringer i konstruerte konstruerer gjennom flere stadier av utviklingen. I tillegg utfyller MRE andre MR metoder for overvåking vev konstruert konstruerer som diffusjon, magnetization overføring, og kjemisk skift analyse ^1.

Når du utfører MRE eksperimenter, bør noen begrensninger noteres. Vurderingen av in vitro-prøver er en tid følsom undersøkelse. Derfor anbefales det at studier skal vare mer enn en time, slik at eventuelle skader på vev begrepet er minimert. I tillegg kan trofast utvinning av stivhet kartet bli kompromittert på grunn Begrepene som enten for små eller stiv ^seks. Påe mulig løsning på dette problemet er å operere på høyere frekvens (> 2,5 kHz), som bølgelengden er omvendt proporsjonal med frekvensen. Piezoelektriske stack aktuatorer drevet av høyspenning forsterkere er i stand til å levere tilstrekkelig bevegelse ved slike frekvenser for å produsere en full skjær bølgelengde i prøven. En annen mulig endring i protokollen er å bruke raskere sekvenser som hurtig spin-ekko og gjenklang Planar ^{11 bildebehandling, 12.}

Utover mulighetene for MRE for vev konstruerte konstruerer in vitro, er neste trinn av pre-klinisk vurdering for å vurdere utviklingen av vev implantert inn i et levende system. Anvendelsen av MRE til mus studier ville gi en mulighet til ikke-destruktiv vurdere utviklingen vevet konstruksjoner. Utvidelse av elastography for behandling av bein eller brusk defekter ville potensielt gi en bedre forståelse av hvordan å produsere mer langvarig funksjonell implantater feller bruk i regenerativ medisin. Magnetisk resonans elastography har potensial til å spille en økende rolle i valideringen av konstruerte konstruerer både in vitro og in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MSCGM-Bullet Kit	Reagent	Lonza Inc.	PT-3001	Store at 4°C
1X DPBS	Reagent	Invitrogen	21600-010
0.05% Trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-054	Store at -20°C
Dexamethasone	Reagent	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Reagent	Sigma-Aldrich	I5879	Store at -20°C
Insulin-bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I6634	Store at -20°C
Indomethacin	Reagent	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Scaffold	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Human mesenchymal stem cells	Cell Line	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T MR Scanner	Equipment	Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Function generator	Equipment	Agilent Technologies	AFG 3022B
Amplifier	Equipment	Piezo Inc.	EPA-104-115
Piezo Bending motor	Equipment	Piezo Inc.	T234-A4Cl-203X
Computer-Linux	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
Computer-Windows	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
MATLAB	Software	Mathworks		2009b