Summary
प्रक्रिया वसा और यांत्रिक सूक्ष्म चुंबकीय अनुनाद elastography (μMRE) का उपयोग गुण की noninvasive स्थानीय मूल्यांकन के माध्यम osteogenic ऊतक इंजीनियर constructs के इंजीनियर परिणाम की निगरानी के लिए चुंबकीय अनुनाद elastography की कार्यप्रणाली को दर्शाता है.
Protocol
1. ऊतक निर्माण तैयार
ऊतक तैयार करने की प्रक्रिया के निर्माण के तीन मुख्य चरण होते हैं: सेल की आबादी का विस्तार, एक biomaterial पाड़ पर कोशिकाओं के बोने, रासायनिक संकेतन अणुओं के उपयोग के माध्यम से और भेदभाव. निर्माण की तैयारी के लिए प्रक्रिया डेनिस एट अल., हांगकांग एट अल, और Marion और माओ 8,9,10 द्वारा किए गए तरीकों पर आधारित है.
- बाद के लिए संस्कृति और सेल लाइन के विस्तार, बीज जेलाटीन स्पंज पर मानव mesenchymal स्टेम सेल (ज MSCs) (4 मिमी व्यास, 3.5 मिमी मोटाई) हड्डी और 3x10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर वसा गठन.
- घंटे MSCs वसा में भेदभाव के लिए, सेल विस्तार मध्यम में वसा शामिल 1 माइक्रोन dexamethasone, 0.5 माइक्रोन isobutyl - methylxanthine, 10 / μg मिलीलीटर से पुनः संयोजक मानव इंसुलिन, और 200 माइक्रोन इंडोमेथासिन मिलकर मीडिया लागूएक बार कोशिकाओं को पाड़ पर मिला हुआ दिखाई देते हैं. तीन दिन के बाद, 10/24 घंटे के लिए विस्तार मीडिया में मानव पुनः संयोजक - इंसुलिन की μg मिलीलीटर तो प्रेरण मीडिया के लिए लौटने के साथ मीडिया की जगह. चक्र तीन बार दोहराएँ और तो रखरखाव मीडिया में हर दो दिन का ही आदान - प्रदान.
- अस्थिजनन प्रेरित करने के लिए, 0.1 माइक्रोन dexamethasone के, एल ascorbic एसिड 2phosphate के 50 माइक्रोन, और सेल विस्तार मध्यम में 10 मिमी β-glycerophosphate के अंतिम एकाग्रता बनाने के द्वारा osteogenic प्रेरण मीडिया तैयार करते हैं. बदलें ताजा osteogenic मीडिया हर दो दिन के साथ.
2. Actuator विशेषता
Actuator के लक्षण वर्णन के MRE प्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. MRE यांत्रिक कतरनी लहरों के प्रसार पर निर्भर करता है यांत्रिक गुणों के स्थानीय मूल्यों का आकलन है, इसलिए, इन यांत्रिक कंपन उत्पन्न और एक piezoelectric actuator का उपयोग हित के ऊतक के भीतर लक्षण वर्णन किया जा आवश्यकता है. एक सचित्र EXAलक्षण वर्णन प्रक्रिया की mple चित्रा 3 में दिखाया जाता है. इस प्रक्रिया का लक्ष्य actuator की गति का अनुकूलन करने के लिए हानिरहित कतरनी लहरों महत्वपूर्ण आयाम (~ 250 माइक्रोन) के साथ उत्पन्न है.
- प्रयोग करने के लिए पहले, 0.5% agarose जेल लागू करने के लिए एक 10 मिमी टेस्ट ट्यूब में निर्माण संलग्न है. जेल का तापमान होना चाहिए 37 लगभग डिग्री सेल्सियस निर्माण करने के लिए नुकसान को कम करने.
- Agarose जेल में पाँच मिनट के कमरे के तापमान पर सेट करने के लिए अनुमति के बाद जेल की सतह में piezoelectric झुकने मोटर की नोक डालें.
- नमूना और एक कठोर समर्थन करने के लिए actuator युक्त ट्यूब संलग्न और यांत्रिक actuator के टिप की ओर लेजर डॉपलर Vibrometer के बीम पूरबी. व्यवस्था की स्थिति को समायोजित करने के लिए परिलक्षित संकेत का अनुकूलन करने के लिए, चिंतनशील टेप का उपयोग करें यदि आवश्यक.
- यांत्रिक actuator की उम्मीद अनुनाद आवृत्ति के आधार पर, समारोह जनरेटर सेट करने के लिए घ स्वीपesired आवृत्ति रेंज एक सफेद शोर संकेत के साथ 20 VPP की एक ऑपरेटिंग वोल्टेज का उपयोग (यानी इस प्रयोग में 20 से 2000 हर्ट्ज).
- Polytec Vibrosoft कार्यक्रम पर विशेषता स्पेक्ट्रम प्रणाली की अनुनाद आवृत्ति की पहचान और FFT और वेग के लिए y-अक्ष के रूप में निर्धारित कार्यक्रम.
- विस्थापन माप के लिए, actuator सेट करने के लिए संकेत अनुनाद आवृत्ति पर एक सतत sinusoid 200 VPP की एक ऑपरेटिंग वोल्टेज का उपयोग देने के लिए, और ध्यान दें उत्पन्न जेल की सतह के लिए दिया जा रहा है विस्थापन. Vibrosoft सेट FFT के लिए y-अक्ष के रूप में विस्थापन के साथ प्रदर्शित करने के लिए.
3. छवि अधिग्रहण
- Actuator के लक्षण वर्णन को पूरा करने के बाद, और एमआरआई स्कैनर के केंद्र में नमूना actuator जगह है. ऊतक का निर्माण प्रयोगों के लिए, प्रसारण और आरएफ संकेत के स्वागत के लिए एक छोटे और अधिक संवेदनशील आरएफ तार (यानी इस प्रयोग में 10 मिमी) का उपयोग करें. (दिखाया प्रक्रिया का उपयोग करता है एक 9.4 टीऊर्ध्वाधर बोर चुंबक ट्रिपल अक्ष gradients, 100 जी / सेमी) के साथ सुसज्जित है.
- निर्माण के स्थान की पहचान के लिए एक स्काउट छवि मोल.
- अधिग्रहण के लिए पैरामीटर सेट. इन विट्रो बाण के समान स्कैन में एक ठेठ 1000 MS, 20-40 एमएस, 0.5-1.0 मिमी, और 128x128 पिक्सल के एक मैट्रिक्स के आकार के साथ 12x10 मिमी 2 के दृश्य के क्षेत्र का टुकड़ा मोटाई की गूंज समय की पुनरावृत्ति समय होगा.
- Elastography पैरामीटर के लिए, लेजर डॉपलर Vibrometer के लक्षण वर्णन के द्वारा निर्धारित मूल्य के लिए actuator के आवृत्ति सेट. वर्तमान अध्ययन में, एक द्विध्रुवी जोड़ी 50 जी / सेमी की एक ढाल आयाम के साथ की जरूरत थी. अन्य पैरामीटर को समायोजित देरी जो प्रारंभिक अधिग्रहण के लिए शून्य मिलीसेकेंड के लिए सेट किया जाना चाहिए शामिल हैं.
- समारोह जनरेटर बदलें मोड फट और समारोह जनरेटर के मापदंडों को समायोजित करने के लिए आवृत्ति और चक्रों की संख्या सहित elastography अधिग्रहण मापदंडों में उन मैच. इसके अलावा, समारोह सेटtion के जनरेटर बाह्य ट्रिगर करने के लिए.
- एक बाण के समान छवि के लिए, गति सकारात्मक टुकड़ा दिशा में होना चाहिए और स्कैन शुरू संवेदीकरण सेट. अधिग्रहण के बाद, छवि की जाँच करें और नकारात्मक टुकड़ा दिशा संवेदीकरण बदल.
- MATLAB के कार्यक्रम है कि अपरुपण तरंग छवि की पीढ़ी के लिए जटिल प्रभाग प्रदर्शन करेंगे चलाएँ.
- कतरनी लहरों और ऐसे चरण लपेटन के रूप में संभव कलाकृतियों की उपस्थिति के लिए छवि का आकलन करें.
- यदि छवि के लिए कोई समायोजन आवश्यक हैं, आठ समान रूप से स्थान दिया गया विशेषता अनुनाद आवृत्ति की एक पूर्ण अवधि के लिए शून्य सेकंड से लेकर मूल्यों के लिए पैरामीटर सरणी के आकार को समायोजित.
- सकारात्मक और नकारात्मक दोनों टुकड़ा झुकाव में स्कैन मोल.
- एक बार छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं, एक MATLAB के छवियों की एक सरणी से अपरुपण तरंग डेटा पैदा करने के लिए डिजाइन कार्यक्रम का उपयोग करें.
4. MRE प्रयोग छवि प्रसंस्करण
- गुई MRE के अंतिम चरण के लिए कतरनी लहर छवियों से कतरनी कठोरता की गणना है. कि तीन आयामी डेटासेट (2 स्थानिक, अस्थायी एक) का आकलन करेंगे MATLAB कार्यक्रम में डेटा रखकर.
नोट: एक planar कतरनी लहर, विस्थापन और इसके Laplacian के एक समारोह के रूप में जटिल मूल्य अपरुपण मापांक के आकलन की अनुमति गति दसगुणा के समीकरण संभालने तक. कलन विधि परिमित अंतर के साथ स्थानिक दूसरे डेरिवेटिव करीब है और एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल आधार पर अपरुपण मापांक गणना. इस जटिल संख्या से, कतरनी लहर गति, लहर क्षीणन, कतरनी कठोरता, कतरनी लोच, कतरनी चिपचिपापन, आदि जैसे कई यांत्रिक मापदंडों के deduced किया जा सकता है एल्गोरिथ्म भी अनुमति देता है जो हित के क्षेत्रों के चयन के लिए माध्य और मानक विचलन की प्रत्येक पैरामीटर की गणना की है.
- इमेजिंग मानकों को कार्यक्रम की शुरुआत में निर्दिष्ट करने की आवश्यकता है. इसके अतिरिक्त वें,ई elastogram की ऊपरी सीमा नमूना में विपरीत अनुकूलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
नोट: कार्यक्रम मध्यवर्ती (कम पास फिल्टर, दिशात्मक फ़िल्टरिंग, अस्थायी FFT, लाइन प्रोफाइल, आदि के बाद लहर के बाद लहर) परिणाम है कि मदद उपयोगकर्ता वसूली की सच्चाई का अनुमान प्रदान करता है.
- कुछ मानकों के रूप में कम पास फिल्टर, गति के अस्थायी आवृत्ति, लहर के प्रसार की दिशा, आदि के स्तर पर ब्याज की एक विशेष क्षेत्र में एक पैरामीटर के मानक विचलन है इस जानकारी के आधार पर समायोजित किया जा सकता है भी गणना की गुणवत्ता का एक संकेतक है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 4 osteogenic और वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला निर्माण के विकास के चार सप्ताह भर यांत्रिक गुणों में परिवर्तन नोट. MRE 730-820 हर्ट्ज में आयोजित किया गया. हालांकि दोनों वरीयता प्राप्त स्पंज लगभग 3 kPa, osteogeni शुरूग निर्देशित ऊतकों 22 kPa की कठोरता में परिणामस्वरूप, वसा, जबकि 1 kPa के लिए कठोरता में कमी आई ऊतकों का निर्देशन किया. इसके अलावा, osteogenic constructs के अध्ययन के अंत में शुरू से की तुलना में आकार में उल्लेखनीय कमी देखी गई. अतिरिक्त elastography अध्ययन से प्राप्त गुण तालिका 1 में दिखाया जाता है.
चित्रा 1 चुंबकीय अनुनाद elastography के लिए छवि अधिग्रहण की प्रक्रिया. छवि अधिग्रहण के दौरान, एक पल्स अनुक्रम (क) (ख) द्विध्रुवी ढ़ाल दालों एमआरआई स्कैनर के साथ समारोह जनरेटर के तुल्यकालन को नियंत्रित करता है. सकारात्मक और नकारात्मक झुकाव में टॉगल द्विध्रुवी ढ़ाल के अधिग्रहण के बाद, (ग) एक कतरनी लहर छवि जटिल विभाजन का उपयोग का उत्पादन किया है.
चित्रा 2. MRE प्रक्रिया के ऊतक इंजन के लिए प्रवाह आरेखजुटी constructs. सबसे पहले, कोशिकाओं (क) पहले और बड़े जनसंख्या आकार डिजाइन परियोजना के लिए आवश्यक करने के लिए विस्तारित. तब कोशिकाओं वरीयता प्राप्त (ख) एक biomaterial पाड़ और रासायनिक अभिकर्मकों पर भेदभाव का संकेत करने के लिए लागू कर रहे हैं. Scaffolds MRE, जिसका पहला कदम है (ग) का निर्माण करने के लिए मिलकर actuator के अनुनाद आवृत्ति के निर्धारण के साथ होती हैं. अगला, एमआरआई छवियों (घ) अपरुपण तरंग छवि (ई) उत्पन्न करने के लिए हासिल किया है. अंत में, एक एल्गोरिथ्म के लिए एक elastogram उपज के लिए लागू किया जाता है (च) है कि नक्शे निर्माण की कठोरता. समवर्ती, constructs ऊतकीय मूल्यांकन (छ) के लिए sectioned हैं क्रम में भेदभाव को मान्य.
चित्रा 3 Actuator लक्षण वर्णन प्रक्रिया. जेलाटीन पाड़ 0.5% agarose जेल से घिरा है. गति नमूना में स्थानांतरित किया जा रहा है एक सफेद शोर विशेषताएँ पहले सिस्टम में भेजा जाता है(1 क) और परिणामस्वरूप गति लेजर डॉपलर Vibrometer (1b) का उपयोग कर पाया है. एक बार अनुनाद आवृत्ति निर्धारित किया जाता है, प्रतिध्वनि में एक निरंतर sinusoid संकेत (2a) (2b) विस्थापन में जेलाटीन पर्यावरण के लिए हस्तांतरित की निर्धारित करने के लिए भेजा जाता है.
चित्रा 4. चार सप्ताह की अवधि से अधिक विकास के नक्शे का निर्माण. वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला (ए) और osteogenic (का.) constructs के बाएँ से इसी परिमाण और कतरनी लहर छवियों, elastogram, और औसत कतरनी कठोरता के साथ सही करने के लिए दिखाए जाते हैं. पट्टी चार्ट और त्रुटि पट्टियाँ की रंग योजना के साथ elastogram मेल खाती है के लिए रंगमैप ब्याज की प्रत्येक निर्माण के क्षेत्र के भीतर मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
तालिका 1 विकास के चार सप्ताह की अवधि में वसा और osteo constructs के यांत्रिक गुणों.
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Discussion
इस प्रक्रिया में, ऊतक इंजीनियर constructs के लिए MRE की प्रक्रिया सेल तैयारी से एक elastogram की पीढ़ी के लिए प्रदर्शन किया है. ऊतक इंजीनियरिंग पाइपलाइन के nondestructive यांत्रिक मूल्यांकन पद्धति लागू करके, यह अब संभव है है के लिए विकास के कई चरणों के दौरान इंजीनियर constructs में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए. इसके अलावा, MRE अन्य एमआर तरीकों के पूरक के लिए निगरानी इंजीनियर ऊतक के रूप में प्रसार, आकर्षण संस्कार स्थानांतरण, और रासायनिक बदलाव 1 विश्लेषण का निर्माण.
MRE प्रयोगों प्रदर्शन, कुछ सीमाएँ ध्यान दिया जाना चाहिए. इन विट्रो नमूनों के मूल्यांकन के समय संवेदनशील अध्ययन है. इसलिए, यह सिफारिश की है कि अध्ययन से अधिक नहीं एक घंटे पिछले ऊतक का निर्माण करने के लिए इतना है कि किसी भी संभावित नुकसान कम से कम है. इसके अतिरिक्त, तो कठोरता नक्शे के वफादार वसूली जा रहा है या तो बहुत छोटे या कठोर 6 constructs वजह से समझौता किया जा सकता है. परई इस समस्या के लिए संभव समाधान के लिए उच्च आवृत्ति (> 2.5 kHz) में संचालित है, के रूप में तरंगदैर्ध्य inversely आवृत्ति के लिए आनुपातिक है. Piezoelectric ढेर उच्च वोल्टेज एम्पलीफायरों के द्वारा संचालित actuators ऐसी आवृत्तियों पर पर्याप्त गति देने के लिए नमूना में एक पूर्ण कतरनी तरंग दैर्ध्य का उत्पादन करने में सक्षम हैं. प्रोटोकॉल के लिए एक और संभव संशोधन के लिए तेजी से स्पिन गूंज गूंज तलीय 11 इमेजिंग, 12 के रूप में तेजी से दृश्यों का उपयोग करने के लिए है.
इन विट्रो में ऊतक इंजीनियर constructs के लिए MRE की संभावनाओं के अलावा, पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के अगले कदम के लिए एक जीवित प्रणाली के में प्रत्यारोपित ऊतकों के विकास का मूल्यांकन है. MRE के माउस के अध्ययन के लिए आवेदन का एक और अवसर प्रदान करने के लिए nondestructively विकास ऊतक constructs का मूल्यांकन होगा. Elastography की हड्डी या कार्टिलेज दोष के उपचार के लिए संभावित विस्तार कैसे लंबे समय तक टिकाऊ कार्यात्मक प्रत्यारोपण च का उत्पादन करने के लिए एक बेहतर समझ प्रदान करेगाया पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोग करें. चुंबकीय अनुनाद elastography दोनों इन विट्रो में और vivo में इंजीनियर constructs के सत्यापन में एक बढ़ती भूमिका निभाने की क्षमता है.
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Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संघर्ष करने के लिए खुलासा किया है.
Acknowledgments
इस शोध में भाग RO3-02-EB007299 NIH और NSF EPSCoR प्रथम पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
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