أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:<em> خارج الحي</em> رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية
Summary
لإجراء تقييم سريع وظيفة الجينات في تطور قشرة الدماغ، ونحن تصف الأساليب التي تنطوي على<em> خارج الحي</em> electroporation من البلازميدات المشترك معربا عن الحمض النووي الريبي المثبطة (رني) وGFP في قشرة الفئران الجنينية. هذا البروتوكول هو قابل لدراسة مختلف جوانب النمو العصبي مثل الخلايا العصبية، والهجرة الخلايا العصبية والخلايا العصبية بما في ذلك التشكل التغصنات وثمرة محور عصبي.
Abstract
قشرة الدماغ يوجه الوظائف العقلية العليا. يتم إنشاء هذا الهيكل 6 الطبقات بطريقة داخل والعشرين خارج الأخير، والذي الخلايا العصبية أول مولود تظل أقرب إلى البطين في حين أن الخلايا العصبية مشاركة لدت تهاجر الخلايا العصبية الماضي أول مولود نحو سطح الدماغ 1. بالإضافة إلى هجرة الخلايا العصبية 2، وهي عملية أساسية لوظيفة القشرية العادي هو تنظيم التشكل العصبية 3. بينما يمكن دراسة التشكل الخلايا العصبية في المختبر في الثقافات الأولية، وهناك الكثير الذي يمكن تعلمه من كيف يتم تنظيم هذه العمليات في بيئات الأنسجة.
وصفنا التقنيات لتحليل الهجرة العصبية و / أو التشكل في شرائح عضوي النمط من قشرة الدماغ 4،6. وتستخدم ناقلات pSilencer المحور الذي يحتوي على كل مروج U6 الذي يدفع الحمض النووي الريبي مزدوج منعطف حاد الذين تقطعت بهم السبل وشريط التعبير الذي يشفر بروتين منفصلة GFP مدفوعة بيا CMV المروج 7-9. نهجنا يسمح للتقييم السريع لعيوب في نمو neurite على ضربة قاضية محددة من الجينات مرشح واستخدمت بنجاح في شاشة للمنظمين من ثمرة neurite 8. فقط لمجموعة فرعية من الخلايا سوف تعبر عن ثوابت رني، شرائح عضوي النمط تسمح لتحليل فسيفساء من الظواهر المحتملة. وعلاوة على ذلك، لأن هذا يتم التحليل في تقريب بالقرب من بيئة في الجسم الحي، ويوفر التكلفة المنخفضة وبديل سريع لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب للجينات وظيفة القشرية غير معروف. أخيرا، بالمقارنة مع التكنولوجيا في electroporation المجراة، فإن نجاح التجارب السابقة electroporation فيفو لا يعتمد على مهارة جراحة تنمية المهارات ويمكن القيام بها مع وقت أقصر التدريب والمهارة.
Protocol
Discussion
هذه الأساليب التي تنطوي على electroporation المجراة سابقا من البلازميدات ترميز مزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي دبابيس الشعر (8) وثقافة شرائح عضوي النمط 4 توفر مزايا عدة متميزة. أولا، هذه الطرق تسمح لإجراء تقييم سريع للرني المستمدة من الظواهر. إدراج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة شيرين البني لتقديم التصور pSil-GFP، والدكتور البير اوزون لتوضيح الشكل 1، والمرفق Bioimaging وديك لمتحد البؤر المجهري. معتمد من قبل جائزة EMM الوظيفي للعلوم الطبية من صندوق ويلكوم بوروز، وهو NARSAD جائزة المحققون الشباب، والمعاهد الوطنية للصحة NCRR كوبر RR018728 P20-01. ويدعم SBL من قبل المعاهد الوطنية للصحة كوبر P20 NCRR RR018728-01، وتلقى الدعم من PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
