Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em> Ex vivo</em> Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias
Summary
Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem a<em> Ex vivo</em> Electroporação de plasmídeos co-expressando RNA inibitória (RNAi) e GFP no córtex embrionário de murídeo. Este protocolo é favorável ao estudo de vários aspectos do neurodesenvolvimento, como neurogênese, migração neuronal e morfogênese neuronal incluindo dendrito e crescimento axonal.
Abstract
O córtex cerebral dirige funções cognitivas superiores. Esta estrutura de seis camadas é gerado no interior um do primeiro, a maneira de fora para último, em que os neurónios primeiros nascidos permanecem mais próximos do ventrículo enquanto que os neurónios últimos nascidos migrar passado os neurónios primeiros nascidos no sentido da superfície do cérebro 1. Além disso a migração neuronal 2, um processo chave para a função cortical normal é a regulação da morfogénese neuronal 3. Enquanto morfogênese neuronal pode ser estudada in vitro em culturas primárias, há muito a ser aprendido a partir de como esses processos são regulados em ambientes de tecido.
Nós descrevemos técnicas para analisar a migração neuronal e / ou morfogénese em fatias organotípicas do córtex cerebral 4,6. Um vetor pSilencer modificado é usado que contém um promotor U6 que impulsiona as duplas de RNA hairpin encalhados e um cassete de expressão separado que codifica a proteína GFP dirigido bya promotor de CMV 7-9. Nossa abordagem permite a rápida avaliação de defeitos no crescimento de neuritos em knockdown específica de genes candidatos e tem sido utilizado com sucesso em uma tela para os reguladores de crescimento neurite 8. Como apenas um subconjunto de células irão expressar as construções RNAi, as fatias organotípicas permitir uma análise do mosaico dos fenótipos potenciais. Além disso, porque esta análise é feita de uma aproximação próxima da ambiente in vivo, ele fornece uma alternativa de baixo custo e rápida para a geração de animais transgénicos ou knockout para os genes de função desconhecida cortical. Finalmente, em comparação com a tecnologia in vivo electroporação, o sucesso de experiências de electroporação ex vivo não é dependente de desenvolvimento proficiente cirurgia habilidade e pode ser realizada com um menor tempo de formação e habilidade.
Protocol
Discussion
Estes métodos envolvem a eletroporação ex vivo de plasmídeos codificando a fita dupla de RNA grampos 8 e cultura de fatias organotípicas 4 oferece diversas vantagens. Primeiro, estes métodos permitem uma avaliação rápida de RNAi derivados de fenótipos. A inclusão de uma GFP codificação expressão cassete no vector pSilencer mesmo que contém o promotor U6 que impulsiona o gancho de cabelo de ARN de cadeia dupla permite uma identificação rápida e caracterização de células…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Dr. Shirin Bonni para proporcionar o construto pSil-GFP, Dr. Alper Uzun para a ilustração da Figura 1, e com a instalação bioimaging Leduc para microscopia confocal. EMM é suportado pelo Prémio Carreira para a Ciência Médica da Burroughs Wellcome Fund, uma NARSAD Prêmio jovens investigadores, e NCRR NIH COBRE P20 RR018728-01. SBL é suportado pelo NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01, e tem recebido apoio do PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
References
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