Metoder för studier av Neuronal Morfogenes:<em> Ex vivo</em> RNAi Elektroporation i embryonal Murine Cerebral Cortex
Summary
Att utföra en snabb utvärdering av funktionen hos gener i utvecklingen av cerebral cortex, beskriver vi förfaranden som involverar<em> Ex vivo</em> Elektroporation av plasmider samuttrycka hämmande RNA (RNAi) och GFP i murina embryonal cortex. Detta protokoll är mottaglig för studiet av olika aspekter av nervsystemets utveckling, t.ex. neurogenes, neuronal migration och neuronal morfogenes med Dendrite och Axon utväxt.
Abstract
Hjärnbarken leder högre kognitiva funktioner. Denna sex skiktad struktur genereras i en inre-first, utanför och sista sätt på vilket den förstfödde nervceller kvar närmare kammaren medan de sista födda neuronerna vandrar förbi de födda första neuronerna mot hjärnans yta 1. Förutom neuronala migration 2, är en viktig process för normal kortikal funktion regleringen av neuronala morfogenes 3. Medan neuronala morfogenes kan studeras in vitro i primära kulturer, det finns mycket att lära av hur dessa processer regleras i vävnad miljöer.
Vi beskriver tekniker för att analysera neuronal migrering och / eller morfogenes i organotypiska skivor av hjärnbarken 4,6. En pSilencer modifierade vektorn användes, som innehåller både en U6 promotor som driver de dubbelsträngade hårnåls-RNA och en separat expressionskassett, som kodar GFP-proteinet drivs bya CMV-promotor 7-9. Vårt tillvägagångssätt möjliggör snabb bedömning av defekter i neuritutväxt på särskild knockdown av gener och har med framgång använts i en skärm för tillsynsmyndigheter av neuritutväxt 8. Eftersom endast en delmängd av celler uttrycker RNAi konstruktionerna, de organotypiska skivor möjliggöra en mosaik analys av de potentiella fenotyper. Dessutom, eftersom denna analys görs i en nära approximation av in vivo-miljö, ger det en låg kostnad och snabbt alternativ till alstring av transgena eller knockout djur för gener med okänd funktion kortikal. Slutligen, i jämförelse med in vivo elektroporering teknik, är en framgångsrik ex försök vivo elektroporation inte beroende av skickliga operation kompetensutveckling och kan utföras med kortare utbildningstid och skicklighet.
Protocol
Discussion
Dessa metoder omfattar ex vivo elektroporering av plasmider som kodar för dubbelsträngat RNA hårnålar 8 och kultur organotypiska skivor 4 ger flera olika fördelar. Först dessa metoder möjliggör en snabb bedömning av RNAi-härledda fenotyper. Införande av en expressionskassett som kodar för GFP i samma pSilencer vektor som innehåller den U6 promotor som driver den dubbelsträngade RNA-hårnålsstruktur möjliggör en snabb identifiering och karakterisering av celler elektroporer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Shirin Bonni för att tillhandahålla den pSil-GFP-konstruktionen, Dr Alper Uzun för illustrationen i figur 1, och den Leduc Bioimaging anläggning för konfokal mikroskopi. EMM stöds av Career Award för Medicinsk vetenskap från Burroughs Wellcome Fund, en NARSAD Young Investigators Award och NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01. SBL stöds av NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 och har fått stöd från PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
