Simple et robuste In vivo Et In vitro Démarche pour l'étude de l'assemblage du virus
Summary
Un moyen simple, efficace et robuste pour synchroniser la livraison de plusieurs composants viraux dans les cellules végétales par le biais<em> Agrobacterium</em> Médiée par l'expression transitoire est décrit. Cette approche est susceptible d'étude de la réplication, l'encapsidation suivie par<em> In vitro</em> Le remontage de la non-virales dans le génome des composants optiques appauvri fantômes virales appropriés pour des applications biomédicales.
Abstract
Dans les virus avec des génomes ARN de sens positif pathogènes pour les humains, les animaux et les plantes, d'encapsidation descendance dans les virions matures et stable est une phase cardinal lors de l'établissement de l'infection chez un hôte donné. Par conséquent, l'étude de l'encapsidation déchiffre les informations concernant le savoir-faire de l'assemblage du virus mécanisme de régulation pour former des virions infectieux. Cette information est essentielle dans la formulation de nouvelles méthodes de freiner la propagation du virus et de lutte contre les maladies. Encapsidation du virus peut être étudiée in vivo et in vitro. Encapsidation du génome in vivo est un processus hautement régulé sélective impliquant des interactions macromoléculaires et de compartimentation subcellulaire. Par conséquent, l'étude menant à disséquer les événements englobant l'encapsidation du virus in vivo permettrait connaissances de base pour comprendre comment les virus prolifèrent et à assembler. Récemment, dans l'encapsidation in vitro a été exploitée pour la recherche dans le domaine de la recherche biomédicale imaGing et les applications thérapeutiques. Les virus des plantes non-enveloppés situer loin devant dans l'aventure de l'encapsidation in vitro dans de la matière chargée négativement étrangère. Virus de la mosaïque Brome (BMV), un agent pathogène non-enveloppé multicomposant virus à ARN pour les plantes, a été utilisé comme un système modèle pour l'étude du génome dans l'emballage vivo et in vitro. Pour les tests d'encapsidation dans Nicotiana benthamiana, au moyen d'Agrobacterium expression transitoire, reportez-vous comme agroinfiltration, est une technique efficace et robuste pour la livraison synchronisée et l'expression de plusieurs composants à la même cellule. Dans cette approche, une suspension de cellules Agrobacterium tumefaciens portant binaires vecteurs plasmidiques portant des ADNc des ARNm desiredviral est infiltré dans la feuille withina espace intercellulaire en utilisant rien de plus sophistiqué qu'une seringue de 1 ml à usage unique (sans aiguille). Ce processus aboutit à la cession de l'insert d'ADN dans des cellules végétales; l'ADN-Tinsert reste transitoirement dans le noyau et est ensuite transcrit par la polymérase II d'accueil, conduisant à l'expression transitoire. La transcription d'ARNm qui en résulte (plafonnés et polyadénylé) est ensuite exporté vers le cytoplasme pour la traduction. Après environ 24 à 48 heures d'incubation, des sections de feuilles infiltrées peuvent être prélevés pour des analyses biochimiques microscopyor. Agroinfiltration permet un grand nombre (centaines ou milliers) de cellules à transfecter simultanément. À l'encapsidation in vitro, de virions purifiés BMV sont dissociés en protéine de capside par dialyse contre un tampon de dissociation du chlorure de calcium contenant suivie de l'élimination de l'ARN et non dissociés virions par centrifugation. Génome sous-unités appauvries protéine de capside sont ensuite remontés avec souhaités composants du génome viral ou non-viraux tels que les composants indocyanine.
Protocol
Discussion
Approche agroinfiltration présentée ici peut largement s'appliquer à un large éventail de virus de plantes. Un des traits caractéristiques de cette approche est synchronisé livraison de multiples agroconstruct à la cellule, un même inconvénient majeur souvent associée à l'inoculation mécanique couramment utilisés des virus des plantes. In vivo et dans les études d'assemblage in vitro utilisant des virus de la mosaïque du brome comme un modèle peut être menée effic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier plusieurs membres du laboratoire pour leurs précieuses suggestions dans le développement de agroinfiltration et dans des essais in vitro de montage. Ce travail a été financé par une subvention de l'Université de Californie. Cette étude a été soutenue dans les régions par une subvention de la National Science Foundation (CBET-1144237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
