간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서 접근법
Summary
를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한 방법<em> Agrobacterium</em> – 중재 과도 표현이 설명되어 있습니다. 이러한 접근 방식은 복제를 공부를위한 의무입니다 encapsidation는 다음<em> 체외에서</em> reassembly 게놈에 비 바이러스 구성 요소는 생물 의학 응용에 적합한 광학 바이러스 귀신을 고갈.
Abstract
인간, 동물과 식물, 자손의 encapsidation 성숙하고 안정적인 virions에 대한 긍정-센스 RNA의 genomes의 병원성과 바이러스에 주어진 호스트에있는 감염의 설립 중에 추기경 단계입니다. 따라서 encapsidation의 연구 노하우 전염성 virions를 형성하기 위해 바이러스 어셈블리를 조절 메커니즘에 관한 정보를 deciphers. 이러한 정보는 바이러스 확산과 질병 통제 curbing의 소설 방법을 공식화에 매우 중요합니다. 바이러스 encapsidation는 생체내 및 시험 관내에서 공부하실 수 있습니다. 생체내의 게놈 encapsidation은 macromolecular 상호 작용과 subcellular compartmentalization 관련된 고도 규제를 선별하는 과정입니다. 따라서 생체내에서 바이러스 encapsidation를 포함한 이벤트가 바이러스 분아 따위에 의해 중식 및 조립 방법을 이해하는 기초 지식을 제공하는 해부하기 위해 선도적인 연구합니다. 최근 시험 관내 encapsidation에 생물 의학 IMA의 영역에서 연구에 악용되었습니다ging 및 치료 응용 프로그램입니다. 비 싸여 식물 바이러스 부정 청구 외국 재료의 시험 관내 encapsidation에의 투자에 앞서 서다. Brome의 모자이크 바이러스 (BMV), 식물 비 싸여 복수 RNA 바이러스 병원성는 생체내 및 시험 관내의 게놈 포장을 연구를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다. Nicotiana benthamiana 공장에서 encapsidation의 assays 들어, Agrobacterium-매개 과도 표현은, agroinfiltration처럼 보이겠 동일한 세포에 여러 구성 요소의 동기화된 전달과 표현에 대한 효율적이고 강력한 기술입니다. 이 접근법에서는 desiredviral mRNAs의 cDNAs 들고 이진 플라스미드 벡터를 나르는 Agrobacterium tumefaciens 전지의 정지 1 ML 일회용 주사기 (바늘없이)보다 더 정교한 아무것도 사용하지 세포 사이 공간 withina 잎으로 침입한다. 식물 세포로의 DNA 삽입의 전송에서 이러한 프로세스 결과, T-DNA인서트는 핵에 transiently 남아 후 호스트 중합 효소 II에 의해 베꼈는데되며, 과도 표현식로 이어지는. 결과 mRNA 성적 증명서는 (뒤덮힌 및 polyadenylated)가 번역을 위해 세포질에 수출되고 있습니다. 부화의 약 24~48시간 후 침투 나뭇잎 부분은 microscopyor 생화 학적 분석을위한 샘플 수 있습니다. Agroinfiltration 동시에 transfected되는 세포의 다수 (수백 수천까지)를 허용합니다. 시험 관내 encapsidation의 경우, BMV의 정화 virions는 원심 분리하여 RNA 및 취소 dissociated virions의 제거 다음에 분리 버퍼가 포함된 염화칼슘으로부터 dialyzing하여 capsid 단백질로 dissociated 있습니다. 게놈 소진 capsid 단백질 subunits 그런 다음 원하는 바이러스성 게놈 구성 요소 또는 염료 indocyanine 같은 비 바이러스성 구성 요소와 재조 립된다.
Protocol
Discussion
여기에 제시된 Agroinfiltration 접근 방식은 널리 식물 바이러스의 광범위한 적용이 될 수 있습니다. 이 방법의 특징 기능은 동일한 세포 – 일반적으로 식물 바이러스의 일상적으로 사용되는 기계적인 접종과 관련된 주요 단점에 여러 agroconstruct의 전송을 동기화됩니다. 생체내과 모델로 brome의 모자이크 바이러스를 이용한 체외 조립의 연구에에 의해 효율적으로 수행할 수 다음과 같은 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 agroinfiltration의 개발과 체외 조립 assays들의 소중한 제안에 대한 실험실의 몇몇 회원을 감사드립니다. 이 작품은 캘리포니아 대학에서 교부금에 의해 재정 지원되었다. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET-1144237)에서 교부금에 의해 부분에서 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
