Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung
Summary
Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren über<em> Agrobacterium</em>-Vermittelte transiente Expression beschrieben. Dieser Ansatz ist zugänglich für die Untersuchung der Replikation, gefolgt von Enkapsidierung<em> In-vitro-</em> Zusammenbau von nicht-viralen Komponenten in optischen viralen Genoms erschöpft Geister geeignet für biomedizinische Anwendungen.
Abstract
Bei Viren mit positiv-sense-RNA-Genome pathogen für Mensch, Tier und Pflanzen, Nachkommen Enkapsidierung zu reifen und stabilen Virionen ist ein Kardinal Phase während die Etablierung der Infektion in einem bestimmten Host. Folglich entziffert Studie von Enkapsidierung die Informationen bezüglich des Know-how des Mechanismus zur Regelung Virus Montage zu infektiösen Virionen zu bilden. Solche Informationen sind bei der Formulierung neuer Methoden zur Eindämmung des Virus Ausbreitung und Bekämpfung der Seuche von entscheidender Bedeutung. Virus Einkapselung kann in vivo und in vitro untersucht werden. Genome Enkapsidierung in vivo ist ein stark regulierter Prozess, der selektive makromolekularen Interaktionen und subzelluläre Kompartimentierung. Daher untersuchen, die zu sezieren Veranstaltungen umfasst Enkapsidierung Virus in vivo würde Basiswissen vermitteln zu verstehen, wie Viren und vermehren sich versammeln. Kürzlich in vitro Einkapselung für die Forschung auf dem Gebiet der biomedizinischen ima ausgenutztGing und therapeutische Anwendungen. Nicht-umhüllten Viren Anlage stehen weit vorne in der Venture von In-vitro-Verpackung der negativ geladenen Fremdkörper. Trespenmosaik-Virus (BMV), ein nicht-umhülltes RNA-Virus Mehrkomponenten pathogenen Pflanzen, wurde als Modellsystem für die Untersuchung Genom Verpackung in vivo und in vitro verwendet. Für Assays Einkapselung in Nicotiana benthamiana, Agrobacterium-vermittelte transiente Expression als Agroinfiltration beziehen, ist eine effiziente und robuste Technik für die synchronisierte Zuführung und Expression von mehreren Komponenten zu der gleichen Zelle. Bei diesem Ansatz wird eine Suspension von Agrobacterium tumefaciens-Zellen, die binäre Plasmid-Vektoren, die Durchführung von cDNAs desiredviral mRNAs in den Interzellularraum withina Blatt mit nichts komplizierter als einer 1 ml Einwegspritze (ohne Nadel) infiltriert. Dieses Verfahren führt zu der Übertragung von DNA-Inserts in Pflanzenzellen, die T-DNAEinsatz bleibt vorübergehend in dem Kern und wird dann durch den Host-Polymerase II transkribiert, die zur transienten Expression. Das resultierende mRNA-Transkript (Obergrenze und die polyadenylierte) wird dann in das Zytoplasma für die Übersetzung ausgeführt. Nach etwa 24 bis 48 Stunden Inkubation, können Teile des infiltrierten Blätter microscopyor biochemische Analysen entnommen werden. Agroinfiltration ermöglicht eine große Anzahl (Hunderte bis Tausende) von Zellen gleichzeitig transfiziert werden. Für In-vitro-Einkapselung sind gereinigten Virionen von BMV dissoziiert Kapsidprotein durch Dialyse gegen Dissoziationspuffer, enthaltend Calciumchlorid durch Entfernen von RNA und undissoziiert Virionen, gefolgt von Zentrifugation. Genome abgereicherten Kapsid-Protein-Untereinheiten werden dann mit den gewünschten viralen Genoms Komponenten oder nicht-viralen Komponenten wie Indocyanin Farbstoff zusammengesetzt.
Protocol
Discussion
Agroinfiltration hier vorgestellte Ansatz kann allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenviren. Ein Erkennungsmerkmal dieses Ansatzes erfolgt die Lieferung mehrerer agroconstruct zu derselben Zelle ein großer Nachteil häufig mit routinemäßig zur mechanischen Inokulation von Pflanzenviren verbunden synchronisiert. In vivo und in vitro-Studien mit Montage Trespenmosaik-Virus als Modell effizient durch geführt werden folgenden einige Tipps. (i) Für die erfolgreiche Infiltration von N. be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei mehreren Mitgliedern des Labors für ihre wertvollen Anregungen bedanken bei der Entwicklung von Agroinfiltration und In-vitro-Assays Montage. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der University of California finanziert. Diese Studie wurde in Teilen durch ein Stipendium der National Science Foundation (CBET-1144237) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
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