Summary

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

Published: March 01, 2012
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Summary

を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法<em>アグロバクテリウム</em>媒介一過性の発現が記載されている。このアプローチは、レプリケーションを研究するための従順で、カプシドは続く<em> in vitroで</em>再構築の非ウイルス性成分のゲノムには、生物医学アプリケーションに適した光学ウイルスの幽霊を枯渇。

Abstract

ヒト、動物や植物、子孫カプシド成熟し安定したウイルス粒子へのプラスセンスRNAゲノム病原性のウイルスで、特定のホストの感染の確立時に基本的な位相である。したがって、キャプシドの研究では、ノウハウ感染性ウイルス粒子を形成するためにウイルスのアセンブリを制御するメカニズムのに関する情報を解読する。このような情報はウイルスの拡散や病気のコントロールを抑制する新規の方法を定式化する際に不可欠である。ウイルスのキャプシド 、in vivo および in vitro 研究することができる。 in vivoでのゲノムのカプシドは、巨大分子の相互作用と細胞内局在を含む高度に調節の選択のプロセスです。したがって、in vivoでのウイルスのキャプシドを包含するイベントを分析するために主要な研究は、ウイルスが増殖し、組み立てる方法を理解する基本的な知識を提供するであろう。最近のin vitroカプシド医学IMAの分野で研究のために利用されていますパトンと治療への応用。非エンベロープ植物ウイルスは、負に帯電した異物 in vitro のキャプシドの合弁会社ではるかに先に立っている。ブロムモザイクウイルス(BMV)、植物への非エンベロープ多RNAウイルスの病原性は、in vivoおよび in vitro におけるゲノムパッケージングを研究するためのモデル系として使用されています。 ニコチアナベンサミプラントカプシド形成アッセイのために、 アグロバクテリウム媒介一過性の発現は、agroinfiltrationなどを参照して同じセルに複数のコンポーネントの同期配信および発現のための効率的で堅牢な技術です。このアプローチでは、desiredviral mRNAのcDNAを運ぶバイナリープラスミドベクターを有するアグロバクテリウムツメファシエンスの細胞の懸濁液を1 mlの使い捨て注射器(針なし)よりも洗練されたものを使用していない間隙withina葉に浸透されています。植物細胞へのDNA挿入物の転送では、このプロセスの結果、T-DNAインサートは、核内に一時的に留まり、その後ホストポリメラーゼIIによって転写される、一過性の発現につながる。得られたmRNA転写物は(キャップ​​とポリアデニル化)し、翻訳の質に輸出されています。インキュベーションは、約24から48時間後、浸潤葉のセクションはmicroscopyor生化学分析のためにサンプリングすることができます。 Agroinfiltration同時にトランスフェクトされる細胞の大量(数百から数千個)を許可します。 in vitroでのキャプシドのために、BMVの精製ウイルス粒子を遠心分離によりRNAを除去すると非解離のビリオンに続く解離緩衝液を含む塩化カルシウムに対して透析によってキャプシドタンパク質に解離しています。ゲノム枯渇キャプシドタンパク質のサブユニットは、希望するウイルスゲノムのコンポーネントまたはそのような色素インドシアニンなどの非ウイルス性のコンポーネントで組み立てられます。

Protocol

1。植物性の素材キャプシドアッセイで使用されるタバコベンサミ植物は、4葉期(約3-4週齢の植物)であるべきである。 2。 agroinfiltrationによる植物細胞への機能的なウイルスゲノムのコンポーネントの配信と表現 1日目:アグロバクテリウム株(例えば、EH 105またはGV 3101)pCass-BMV RNA 1、BMV RNA 2とBMV RNA 3 1,2を保有する 50のカ…

Discussion

ここに提示Agroinfiltrationのアプローチは、広く植物ウイルスの広い範囲に適用することができます。このアプローチの特徴機能は同じ細胞一般に植物ウイルスの日常的に使用される機械的な接種に関連付けられている主な欠点に複数のagroconstructの配信を同期化されています。in vivoおよび in vitroのアセンブリ研究ではモデルとしてブロムモザイクウイルスを用いて効率的?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、agroinfiltrationの開発およびin vitroアセンブリアッセイにおけるそれらの貴重な提案のための研究室のいくつかのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、カリフォルニア大学からの助成金によって賄われていた。本研究では、国立科学財団(CBET-1144237)からの助成金によって部分でサポートされていました。

Materials

Name of the reagent Company Catalog number
MES Sodium salts Sigma-aldrich M2993
Indocyanine green Sigma-aldrich I2633
Beckman ultracentrifuge Beckman Coulter Model: L8-70M
Centricon-100 column Millipore YM-100
Spectrophotometer Cary 50, Varian Inc. Part number
10068900
Spectrofluorometer Fluorolog 3, Jobin-Yvon. Part number FL3-21

References

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Cite This Article
Chaturvedi, S., Jung, B., Gupta, S., Anvari, B., Rao, A. Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly. J. Vis. Exp. (61), e3645, doi:10.3791/3645 (2012).

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