Summary
Explantat från mitthjärnan dopaminsystemet och striatum används i en kollagenmatris analys för
Abstract
Mitthjärnan dopamin (MDDA) neuroner projekt via den mediala framhjärnan bunt mot flera områden i telencephalon, inklusive striatum 1. På motsvarande sätt medelstora taggiga neuroner i striatum som ger upphov till striatonigral (direkt) väg innerverar substantia nigra 2. Utvecklingen av dessa axon trakter beror på de kombinatoriska agerande en uppsjö av axon tillväxt och signaler vägledning, inklusive molekyler som frisätts av neuriter eller (mellan) målregioner 3,4. Dessa lösliga faktorer kan studeras in vitro genom odling MDDA och / eller striatala explantat i en kollagen-matris som ger en tredimensionell substrat för axonerna imiterar extracellulära miljön. Dessutom medger den kollagen-matris för bildning av relativt stabila gradienter av proteiner som frisätts av andra explantat eller celler som placeras i området (se t.ex. referenserna 5 och 6). Här beskriver vi metoder för förvärvsmetodenification av råttsvanskollagen, mikrodissektion av dopaminerga och striatala explantat, kultur i kollagengeler och efterföljande immunohistokemisk och kvantitativ analys. Först hjärnan hos E14.5 musembryon är isolerade och dopaminerga och striatala explantaten microdissected. Dessa explantat därefter (sam) odlades i kollagengeler på täckglas i 48 till 72 timmar in vitro. Därefter axonala prognoserna visualiseras med neuronala markörer (t.ex. tyrosinhydroxylas, DARPP32 eller βIII tubulin) och axon tillväxt och attraktiva eller repulsiva svar axon är kvantifierade. Detta neuronala preparat är ett användbart verktyg för in vitro-studier av de cellulära och molekylära mekanismer för mesostriatal och striatonigral axon tillväxt och vägledning under utveckling. Användning av denna analys är det också möjligt att utvärdera andra (mellanliggande) mål för dopaminerga och striatala axoner eller för att testa specifika molekylära signaler.
Protocol
1. Framställning av råttsvanskollagen
- Samla 6-10 vuxen råtta svansar (Det är möjligt att lagra de bakre ändarna vid -20 ° C tills användning).
- Blötlägg svansar i 95% etanol över natten vid rumstemperatur (RT).
Dissektion av skolästfiskar (i vävnadskultur huv):
(Håll verktyg i 70% etanol när du inte använder dem och se till att alla lösningar, verktyg och glas som används i denna procedur är sterila)
- För att samla senor från svansen, skär bort toppen av svansen. Hålla stora änden av svansen med en pincett. Använd en annan pincett att hålla, böja och bryta svansen nära andra tång. Dra isär och senor kommer att hamna på efterkälken (Figur 1 A, B).
- Samla senor i sterilt H 2 O och efter samla alla senor flytta dem till en ny petriskål med steril H 2 O.
- Ta 2-3 senor och strimla dem med 2 par förCEPS i en ny petriskål med steril H 2 O. Avlägsna icke-senvävnad som vener (senvävnad är glänsande och reflekterande, Figur 1C). Efter avlägsnande av alla icke-senvävnad, ger varje svans ca 100-150 mg av senor.
- Överföra senorna till 300 ml steril 3% ättiksyra och omrör långsamt över natten vid 4 ° C.
- Tillsätt en ytterligare 200 ml av steril 3% ättiksyra och omrör långsamt över natten vid 4 ° C.
- Centrifugera ättiksyralösning innehållande senorna vid ~ 2700 X g under 120 minuter vid 4 ° C för att pelletera icke-upplösta senor och icke-senvävnaden.
- Under centrifugeringen förbereder dialysrör:
- skär bitar av 40 cm
- koka i 500 ^ M EDTA under 5 min
- svalt i sterilt H 2 O
- Knyt en knut i ena änden av dialys slangen och fyll slangen med supernatanten av den centrifugerade senan lösningen på is i vävnadskultur köksfläkten med en automatisk pipette och en 25 ml pipett. Undvik att producera bubblor. Knut den andra änden av slangen och lagra röret på sterilt aluminiumfolie på is till dess att alla delar av slangen är fyllda (Figur 1D).
- Framställ 10 liter steril 0,1 X MEM, pH 4,0, i vävnadskultur huven. Lägg flottör i bitar av rör och lägga dessa till den nedkylda 0,1 x MEM lösning i ett 10 liter bägare. Dialysera natten vid 4 ° C under långsam omrörning. Denna dialys avlägsnar överskott av syra under det att pH-värdet låg.
- Ersätt med nya förkyld 10 l 0,1 X MEM och rör över natten vid 4 ° C.
- Upprepa föregående steg genom att ersätta med nya förkyld 10 l 0,1 X MEM och rör över natten vid 4 ° C.
- Alikvot kollagenlösningen i sterila 50 ml rör. Lagra alikvoter vid 4 ° C. Håll 6-12 månader, bara hantera kollagen beståndet i vävnadskultur huven.
- Det är viktigt att testa huruvida det renade kollagenet måste spädas (i 0,1 x MEM) för att erhålla optimala resultat i kollagen matrix-analys. Därför genererar en serie kollagen utspädning (outspätt kollagen, 1:1, 1:2 och 1:5 utspädning) och utföra analyser kollagenmatrisen som beskrivs nedan för att bestämma den optimala kollagen utspädning.
2. Dissektion av det dopaminerga mitthjärnan 7.8
- Dissekera E14.5 musembryon från livmodern hos modern och hålla L15 medium på is tills det behövs.
Alla efterföljande dissekering steg utförs i L15-medium på is.
- Dissekera ut hjärnan.
- Avlägsna telencefalon genom att skära längs det mediala partiet av varje telencephalic vesikel (använd telencephalic vesiklar för striatala explantat).
- Ta bort meningeal skidan.
- Gör en dorsoventral snitt strax rostralt av mesencefal böjning.
- Gör en ny dorsoventral snitt strax kaudalt om mesencefal böjning.
- Gör en rostrokaudal snitt längs ryggens mittlinje med hjälp av en microdissection kniv för att exponera den underliggande ventrala mitthjärnan vävnad. Var noga med att inte träffa ventrala mitthjärnan vävnaden som innehåller dopaminerga neuronerna (figur 2).
- Gör två rostrokaudal snitt laterala och parallellt med den ventrala mittlinjen för att avlägsna dorsala mitthjärnan vävnad.
- Dela upp de återstående ventrala mitthjärnan vävnad till explantaten med en mikrodissektion kniv.
- Lagra explantaten i L15-medium innehållande 5% FBS på is fram till användning.
3. Dissektion av striatum
Alla dissekering steg utförs i L15-medium på is.
- Använd telencephalic blåsor dissekerade under mitthjärnan dissektion.
- Avlägsna thalamus genom att skära in mellan talamus och striatum med användning av pincett.
- Gör en mediolateral rostralt striatum för att ta bort rostrala strukturer som luktloben. Upprepa detta steg för mjukpapper ligger kaudalt till striatum.
- Positionden återstående segment för erhållande av en koronal vy av striatum (figur 2).
- Striatum kan anses som en något mindre tät (mer transparent) del av vävnad. Dissekera ut striatum och skuren i explantaten med en mikrodissektion kniv. Undvik något mörkare vävnaden nära mittlinjen som innehåller migrerar nervceller i den laterala och mediala ganglion företräde.
- Lagra explantaten i L15-medium innehållande 5% FBS på is fram till användning.
4. Montering collagenmatris analyser
Beredning av kollagen (alla steg på is, använd kyls pipettspetsar)
- Blanda 860 | il utspädd kollagen med 100 pl av 10X MEM och 40 pl av 1 M natriumbikarbonat (NaHCOs 3) och håll på is. Om vid denna tidpunkt kollagen värms upp kommer det att stelna.
- Tillsätt en droppe 20 pl (cirka 5 mm i diameter) av beredda kollagen till ett täckglas i en brunn i en 4-brunnars Nunc skåloch låta det stå i en CO2 inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under 30 min (vid omgivande O 2-koncentrationen är tillräckligt). Under denna inkubering kollagen kommer gelatinera.
Setup co-kultur i kollagengel
- Efter att kollagen har gelatineras, använd en pipett med en 200 ul tips för att överföra en dopaminerg eller striatum explantat till kollagen.
- Flytta explantaten i omedelbar närhet till varandra med hjälp av en nål. Håll isär dem på ett avstånd av ungefär diameter på en explantation (cirka 200-300 m) (Figur 2).
- Avlägsna överskott av mediet och tillsätt 20 | il av beredda kollagen ovanpå explantaten. Detta kommer ofta orsakar explantaten att flytta runt. Ompositionera explantaten med användning av en nål som beskrivs i 4,4.
- Låt kollagen stelna under 15 minuter vid RT, följt av 30 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter att kollagen har satt, tillsätt 400 pl explant medium och växa under 2-3 dagar i en CO2-inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
5. Analys genom immunohistokemi och Kvantifiering
Immunohistokemi
- För att fixera explantat, försiktigt tillsätt 400 pl av 8% paraformaldehyd (PFA) i PBS till 400 | il medium (vilket utspädning av PFA till 4%) och låt stå under 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x 15 min i PBS vid rumstemperatur.
- Inkubera i blockeringsbuffert (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) under 2 timmar.
- Inkubera över natten med primär antikropp i BB vid 4 ° C. För dopaminerga axoner använda anti-tyrosin hydroxylas-antikroppar (1:1000) 7, för striatala axoner anti-DARPP32 antikroppar (1:500) 9 och för att visualisera alla axoner anti-βIII tubulin (1:3000) 7.
- Tvätta 5x 1 timme i PBS vid rumstemperatur.
- Inkubera med sekundär antikropp konjugerad till en lämplig fluorofor (1:500) i BB natten vid 4C. Från detta steg på minimera exponeringen av explantaten för ljus (t.ex. täcka dem med aluminiumfolie).
- Tvätta över natten i PBS vid 4 ° C följt av flera tvättar under nästa dag.
- Montera explantat på objektglas med Förläng antifad reagens monteringsmedium. Tillsätt en droppe ~ 10 | il på en glasmikroskopskiva. Ta täckglaset och försiktigt placera den på droppe monteringsmedium med explantatet nedåt. Undvik att droppa något luft under de täckglas av mycket försiktigt sänka den på droppe monteringsmedium.
Kvantifiering genom beräkning P / D-förhållande
- Förvärva digitala bilder av explantaten med användning av en epifluorescensmikroskop (figur 3).
- Med användning av dessa bilder, dividera varje explantat i kvadranter för att generera en proximal kvadranten (dvs. en del av explantatet närmast intilliggande explantatet) och en distal kvadrant (del av explantatet längst bort från den angränsande förklaringnt) (figur 2, 4).
- Mät längden på 20 längsta neuriter nya från explantatet både i proximala och distala kvadranter.
- Använda den genomsnittliga längden av de 20 längsta neuriter att beräkna P / D-förhållande för varje individuell explantat. AP / D-förhållande> 1 anger Axon attraktion, samtidigt som ett förhållande <1 anger Axon repulsion.
- I vissa fall hindrar den täta tillväxten av neuriter bedömning av enskilda neurit längd. I dessa situationer kan kvantifiering utföras genom att mäta avståndet mellan kanten av explantatet och den ledande front axontillväxt i de proximala och distala kvadranter.
6. Representativa bilder
Efter framgångsrik odling av dopaminerga och striatala explantat ett stort antal axoner är synliga med användning av ljusa fält mikroskopi eller såsom visualiseras med anti-tubulin βIII immunocytokemi (ej visad). En undergrupp av dessa axoner kommer att vara dopaminerga eller S triatal axoner som visualiseras med immuncytokemi (Figur 3). Genom att dividera explantaten i kvadranter, såsom beskrivs och bestämning P / D-förhållanden, kan en förmodad axonet attraktiv eller repellerande effekt kvantifieras (figur 3E).
Figur 1. Bilder som illustrerar framställningen av kollagen från råttsvanssenor. A) Dra isär råttsvans exponerar senor. B) Senor är synliga som rep-liknande buntar. C) senor är lätta att skilja från vener genom sin skinande vita utseende. D) Efter upplösning i senor i ättiksyra, lösningen överfördes till dialysrör. För att hålla den upplösta kollagen kalla rören placeras på sterila aluminiumfolie på is.
e 2 "src =" / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg "/>
Figur 2. Schematisk visar de olika stegen i förfarandet. Lämpliga områden i hjärnan dissekeras och skärs för att generera explantat. En enda mitthjärnan och striatala explantatet är placerade i omedelbar närhet i en kollagenmatris och lämnas att växa under 48-72 timmar vid 37 ° C. Axoner visualiseras genom fluorescens immunohistokemi och ett P / D-förhållande beräknas för att kvantifiera chemotropic responser.
Figur 3. Representativa resultat visar axontillväxt i en kollagenmatris kultur. A) mitthjärnan explant färgas med anti-tyrosin hydroxylas antikroppen avslöjar Axon utväxt. Streckade linjen anger intill explantat. B) Förstoring av A visar individuella neuriter och koner tillväxtfaktorer (pilar). C) Striatal explantatet färgades med anti-DARPP32. D) Förstoring av C visar individuella neuriter. E) Exempel påP / D förhållande kvantifiering. Explantaten delas i lika kvadranter. Den proximala kvadranten är vänd den intilliggande explantatet, medan den distala kvadranten är vänd bort från den. Skalstrecken indikerar 100 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kollagenmatrisen analysen som beskrivs här har använts och förbättrats av många olika laboratorier under de senaste decennierna för att undersöka en rad olika axon vägledning molekyler och neuronala system (se t.ex. referenser 5-8). Dessa studier har visat att denna analys är ett kraftfullt verktyg för att studera effekterna och reglering av axon vägledande molekyler som utsöndras av olika (bra) målvävnader.
Emellertid bör det noteras att kollagenmatrisen är ett substitut för den extracellulära miljön (ECM), men klart saknar många proteiner som normalt finns i ECM. Komponenter i ECM är kända för att påverka effekterna av axon vägledning molekyler 10. Icke desto mindre är kollagenmatrisen analysen särskilt användbar för undersökning av basiska molekylära mekanismer in vitro och i kombination med andra metoder för vävnadsodling (t ex organotypiska kulturer skiva 11) eller analys av genetiskt manipulerade djurmodeller. Flera faktorer avgör hur framgångsrik kollagenmatrisen analysen. För det första är storleken av explantaten avgörande för optimal axontillväxt. Stora dopaminerga och striatum explantaten visa ofta begränsad Axon tillväxt medan små explantat visar oregelbundna och fasciculated utväxt. Vidare påverkar avståndet mellan de individuella explantat kraftigt effekten en utsöndrad molekyl kan utöva på intilliggande explantat. Om explantaten är för långt ifrån varandra, kommer diffunderbara molekyler inte att nå explantaten. Omvänt, när avståndet är för liten axoner kan växa in i angränsande explantaten, vilket gör det svårt att kvalitativt och kvantitativt bedöma axon tillväxt och vägledning. Slutligen, är kvaliteten på den råttsvanskollagen viktig och är direkt korrelerad med utväxt av axoner och överlevnad av explantat.
Analysen som beskrivs här kan modifieras på olika sätt att behandla specifika frågeställningar. Till exempel, tillsats avFunktionen blockerande antikroppar till tillväxtmediet medger den funktionella hämning av (kandidat) molekyler. Dessutom kan explantat kombineras med cellaggregat som utsöndrar specifika axontillväxt och faktorer vägledning. Slutligen kan explantat erhållas från GFP reporter möss vilka specifika neuronala populationer och deras axoner är märkta. Med denna inställning kan axoner följas under kollagenmatrisen analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Kollagenmatrisen Analysen har utvecklats och förbättrats av arbetet av många olika forskargrupper under de senaste två till tre decennier. De metoder som beskrivs här för dopaminerga och striatum explantaten stor nytta dessa studier. Dessutom skulle författarna tacka Asheeta Prasad för hennes hjälp med att upprätta striatala explantatodlingarna. Arbetet i labbet har finansierats av Human Frontier Science Program Organisation (Career Development Award), Nederländerna Organisationen för Health Research och utveckling (ZonMW-VIDI och ZonMW-TOP), den Europanian unionen (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222.999) (till RJP) och Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (TopTalent, för att ERES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J.
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J.
- Chilton, J. K.
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
