In vitro Mätningar av trakeal Sammandragning Använda möss
Summary
Transgena möss har varit mycket användbar i tillskriva fysiologisk funktion gener. Som sådan forskning i allmänhet, och funktionella studier av luftvägarna, i synnerhet, har genomgått en anmärkningsvärd förskjutning mot murina modeller. Här ger vi protokoll för<em> In vitro</em> Luftstrupe sammandragning studier för att utvärdera glatt muskulatur funktion i murin luftvägarna.
Abstract
Transgena möss och knockout har varit kraftfulla verktyg för att utreda fysiologi och patofysiologi av luftvägarna 1,2. In vitro tensometry av isolerade trakea preparat har visat sig vara en användbar analys av luftvägarnas glatta muskulatur (ASM) kontraktila responsen i genetiskt modifierade möss. Dessa in vitro-luftrör preparat är relativt enkla, ger en robust svar och behålla både funktionella kolinerga nervändar och svar muskler, även efter lång inkubationer.
Trakeal tensometry tillhandahåller även en funktionell analys för att studera ett antal olika andra reaktionsvägar budbärar signalering som berör kontraktion av glatt muskulatur. Nedgång i luftstrupen medieras huvudsakligen via parasympatiska och kolinerga nerver som frisätter acetylkolin på ASM (figur 1). De stora ASM acetylkolinreceptorer är muskarin M2 och M3 som är G I / O och GQ receptorer respektive <sup> 3,4,5. M3-receptorer väcker kontraktion av koppling till Gq att aktivera fosfolipas C, ökar IP3 produktion och IP3-medierad kalcium befrielse från sarkoplasmatiska retiklet 3,6,7. M2 / g I / O-signalering antages förbättra kontraktioner genom hämning av adenylatcyklas som leder till en minskning i cAMP-nivåer 5,8,9,10. Dessa vägar utgör den så kallade "farmakologiska kontraktionskopplingen" av glatt muskulatur i luftvägarna 11. Dessutom innefattar kolinerga signalering genom M2-receptorer (och moduleras av M3-signalering) vägar att depolarisera ASM som i sin tur aktiverar L-typ, spänningsberoende kalciumkanaler (figur 1) och kalciuminflöde (så kallad "excitering-kontraktionskopplingen" ) 4,7. Mer detaljerade omdömen om signalvägar som styr luftvägssammandragning finns 4,12. Ovanstående vägar verkar vara konserverade mellan möss och andra arter. Men, mus trakea skiljer sig från andra arter in del signalvägar. Mest framträdande är deras brist på kontraktila svar på histamin och adenosin 13,14, båda välkända ASM modulatorer hos människor och andra arter 5,15.
Här presenterar vi protokoll för isolering av murina trakeala ringarna och in vitro-mätning av deras kontraktila effekt. Innefattade är beskrivningar av utrustningskonfiguration, luftstrupe ringen isolering och kontraktila mätningar. Exempel ges för att framkalla sammandragning indirekt med användning av hög kaliumhalt stimulering av nerver och direkt genom depolarisering av ASM muskel för att aktivera spänningsberoende kalciuminflöde (1. Hög K *, figur 1). Dessutom metoder presenteras för stimuli av nerver enbart med hjälp av elektriskt fält stimulering (2. EFS, figur 1), eller för direkt stimulering av ASM muskler att använda exogent signalsubstans tillämpas på badet (3. Exogena ACH, figur 1). Detta flexibility och enkel framställning gör isolerad trakea ringen modell en robust och funktionell analys för ett antal signaleringskaskader involverade i luftvägarnas glatta muskulatur.
Protocol
Discussion
Protokollet som presenteras här ger en fysiologiskt beredning för att utvärdera luftvägsmuskel funktion. Vi generellt verkar 3-4 förberedelser organbadet samtidigt, dock färdigförpackade system är tillgängliga från ett antal leverantörer som möjliggör samtidiga mätningar på upp till 8 preparat (ADInstruments, Världen precisionsinstrument, och Harvard Apparatus). Vi har använt ett antal kraftgivarna och vävnadsbad orgel med motsvarande resultat. Men finner vi att elektriskt fält stimulering ger viss va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats genom anslag från Centrum för Innovation i förebyggande och behandling av luftvägssjukdomar, NINDS bidrag (NS052574) och från Sandler Program för astmaforskning.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
