In vitro Målinger av tracheal Sammensnøring Bruke Mus
Summary
Transgene mus har vært svært nyttig i tillegge fysiologiske funksjon til gener. Som sådan, forskning generelt, og funksjonelle studier av luftveier, spesielt, har gjennomgått en bemerkelsesverdig forskyvning mot murine modeller. Her gir vi protokoller for<em> In vitro</em> Trachea innsnevring studier for å evaluere glatt muskel funksjon i murine luftveier.
Abstract
Transgene og knockout mus har vært kraftige verktøy for etterforskningen av fysiologi og patofysiologi av luftveiene 1,2. In vitro tensometry av isolerte tracheal preparater har vist seg å være en nyttig analyse av luftveiene glatt muskulatur (ASM) kontraktile respons på genmodifiserte mus. Disse in vitro tracheal preparater er relativt enkel, gir en robust respons, og beholde både funksjonelle kolinerge nerveender og muskel respons, selv etter lang Inkuberinger.
Tracheal tensometry gir også en funksjonell analyse for å studere en rekke andre messenger signalveier som påvirker sammentrekning av glatt muskulatur. Sammentrekning i luftrøret er hovedsakelig mediert av parasympatiske og kolinerge nerver som utløser acetylkolin på ASM (figur 1). De store ASM acetylkolinreseptorer er muskarin M2 og M3 som er G i / o og GQ koblede reseptorer, henholdsvis <sup> 3,4,5. M3 reseptorer fremkalle sammentrekning av kopling til GQ å aktivere fosfolipase C, øker IP3 produksjon og IP3-mediert kalsium utgivelse fra sarcoplasmic retikulum 3,6,7. M2 / G i / o signalisering antas å øke sammentrekninger ved hemming av adenylat cyclase fører til en nedgang i Camp nivåer 5,8,9,10. Disse banene utgjør den såkalte "farmako-sammentrekning kobling" av luftveiene glatt muskulatur 11. I tillegg innebærer kolinerge signalering gjennom M2 reseptorer (og modulert av M3 signalering) veier som depolarize ASM som igjen aktiverer L-type, spenning-kalsiumkanaler (figur 1) og kalsium tilstrømning (såkalt «eksitasjon-kontraksjon kopling" ) 4,7. Mer detaljerte vurderinger på signalveier som styrer Airway innsnevring kan bli funnet 4,12. Ovennevnte stier ser ut til å bli konservert mellom mus og andre arter. Men mus tracheas skiller seg fra andre arter in noen signalveier. Mest fremtredende er deres mangel på kontraktile respons på histamin og adenosin 13,14, begge velkjente ASM modulatorer i mennesker og andre arter 5,15.
Her presenterer vi protokoller for isolering av murine tracheal ringer og in vitro måling av deres kontraktile utgang. Inkludert er beskrivelser av utstyret konfigurasjonen, luftrøret ring isolasjon og kontraktile målinger. Eksempler er gitt for fremkaller sammentrekninger indirekte ved hjelp av høy kalium stimulering av nerver og direkte ved depolarisering av ASM muskler for å aktivere spenning avhengig kalsium innstrømning (1. Høy K +, Figur 1). I tillegg er metodene som presenteres for stimuleringer av nerver alene ved hjelp av elektrisk felt stimulering (to. EFS, figur 1), eller for direkte stimulering av ASM muskel bruker eksogene nevrotransmitter brukes på bad (3. Eksogene ACH, en figur). Dette FLExibility og enkel tilberedning gjør det isolerte luftrøret ringen modell en robust og funksjonell analyse for en rekke av signalanlegg kaskader involvert i luftveiene glatt muskel sammentrekning.
Protocol
Discussion
Protokollen presenteres her gir en fysiologisk forberedelse til å vurdere luftveier muskelfunksjon. Vi generelt opererer 3-4 orgel bad preparater samtidig, men prepackaged systemer er tilgjengelig fra en rekke leverandører som tillater samtidige målinger på opp til 8 preparater (ADInstruments, World presisjonsinstrumenter, og Harvard Apparater). Vi har benyttet en rekke force transdusere og vev orgel bad med tilsvarende resultater. Men finner vi at elektrisk felt stimulering gir litt variasjon basert på små forskj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra Senter for Innovasjon i forebygging og behandling av luftveissykdommer og NINDS Grant (NS052574), og fra Sandler Program for Astma Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
