Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten
Summary
De fibroblast explantaatkweek protocol uit menselijke huid stansbiopsieën is een technisch robuuste en eenvoudige manier om huidcellen te leiden binnen 4-8 weken voor het bankwezen van ongeveer 15-20 miljoen cellen bij een lage passage nummer.
Abstract
Weefsels en cellijnen afgeleid van een individu met de ziekte zijn ideaal bronnen ziektegerelateerde cellulaire fenotypes bestuderen. Patiënten afkomstige fibroblasten in dit protocol zijn met succes gebruikt bij de afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen tot modelziekte 1. Vroege passages van deze fibroblasten kunnen ook worden gebruikt voor cel-gebaseerde functionele assays voor specifieke biologische veranderingen, mechanismen 2 en volgende geneesmiddelen screeningsmethoden bestuderen. Het voordeel van het gepresenteerde protocol via enzymatische procedures zijn 1) de reproduceerbaarheid van de techniek van kleine hoeveelheden weefsel afkomstig van oudere patiënten, bijvoorbeeld patiënten die met de ziekte van Parkinson, 2) de technisch eenvoudige benadering via moeilijker methodologieën middels enzymatische behandelingen, en 3 ) de tijd houden: dit protocol duurt 15-20 minuten en kan direct na aankomst biopsie worden uitgevoerd. Enzymatische behandelingen kan tot 4 uur en hebben de problemen vanoverdigestion, vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende aanhechting van cellen wanneer ze niet goed behandeld. Dit protocol beschrijft de ontleding en de bereiding van een 4-mm menselijke huidbiopsie voor het afleiden van een fibroblast cultuur en heeft een zeer hoog slagingspercentage wat belangrijk is bij de behandeling van patiënten afkomstige weefselmonsters. In deze cultuur, keratinocyten migreren uit de biopsie weefsel binnen de eerste week na de bereiding. Fibroblasten weergegeven 7-10 dagen na de eerste uitloper van keratinocyten. DMEM hoge glucose media aangevuld met 20% FBS bevordert de groei van fibroblasten dan keratinocyten en fibroblasten zal de keratinocyten overwoekeren. Na 2 passages keratinocyten werden verdund uit wat resulteert in relatief homogene fibroblastculturen die de fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47) uitdrukt. Met deze aanpak kan 15-20000000 fibroblasten worden afgeleid in 4-8 weken voor mobiele bankieren. De huid dissectie duurt ongeveer 15-20 minuten, worden de cellen dan een keer per dag bewaaktonder de microscoop, en de media werden elke 2-3 dagen na hechting en uitgroei van cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met dit protocol, kan relatief zuivere culturen van de huid fibroblasten worden verkregen. De fibroblasten hebben karakteristieke morfologische kenmerken van langwerpige, spindel-achtige cellichamen, rond tot ovaal celkernen, en de fibroblasten groeien uitgelijnd en in bundels bij samenvloeiing. De media ondersteunt de groei van fibroblasten terwijl andere celpopulaties zoals keratinocyten nodig extra toeslagen en groeifactoren, of zijn mitotically minder actief, dit zorgt voor relatief zuiver fibroblastculture…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ontwikkeling van dit protocol werd gefinancierd door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM, TR1-01246) en Parkinson Alliance.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson’s disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson’s Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
