Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Summary

Die Fibroblasten Explantatkultur Protokoll aus der menschlichen Haut Stanzbiopsien ist eine technisch robuste und einfache Weise abzuleiten Hautzellen innerhalb von 4-8 Wochen für Banken von etwa 15-20 Millionen Zellen auf einem niedrigen Durchgang Nummer.

Abstract

Geweben und Zelllinien von einem Individuum mit der Krankheit abgeleitet sind eine ideale Quelle zu krankheitsbedingten zellulären Phänotypen zu studieren. Patienten stammenden Fibroblasten in diesem Protokoll wurden erfolgreich in der Ableitung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu modellieren Krankheit ¹ verwendet. Frühen Passagen dieser Fibroblasten können auch zellbasierten funktionellen Assays verwendet werden, um spezifische Krankheitsbahnen Mechanismen ² und nachfolgende Wirkstoff-Screening-Ansätzen zu studieren. Der Vorteil der vorgestellten Protokoll über enzymatische Verfahren sind 1) die Reproduzierbarkeit der Technik von kleinen Mengen von Gewebe von älteren Patienten, zB Patienten mit Parkinson-Krankheit, 2 betroffen) der technisch einfachen Ansatz über schwierigere Methoden mittels enzymatischer Behandlungen abgeleitet und 3 ) die Zeit berücksichtigt: Dieses Protokoll dauert 15-20 min und kann sofort nach der Ankunft Biopsie durchgeführt werden. Enzymatische Behandlungen kann bis zu 4 Stunden und haben die Probleme deroverdigestion, Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen und die anschließende Befestigung der Zellen, wenn sie nicht richtig gehandhabt. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation und Herstellung einer 4-mm menschlichen Hautbiopsie zur Ableitung eines Fibroblasten-Kultur und hat eine sehr hohe Erfolgsquote, die wichtig ist, wenn man mit einem Patienten abgeleitete Gewebeproben. In dieser Kultur, Migration Keratinozyten aus der Biopsie Gewebe innerhalb der ersten Woche nach der Zubereitung. Fibroblasten erscheinen 7-10 Tage nach der ersten Folge von Keratinozyten. DMEM high glucose Medium mit 20% FBS begünstigt das Wachstum von Fibroblasten in Keratinozyten und Fibroblasten werden die Keratinozyten überwuchern. Nach 2 Passagen Keratinozyten wurden durchgeführt, was zu relativ homogenen Fibroblastenkulturen die die Fibroblasten-Marker SERPINH1 (HSP-47) drückt verdünnt. Mit diesem Ansatz können 15-20 Millionen Fibroblasten in 4-8 Wochen für die Zell-Banking abgeleitet werden. Die Haut Präparation dauert etwa 15-20 min werden die Zellen dann überwacht einmal täglichunter dem Mikroskop und Medien alle 2-3 Tage nach der Befestigung und Auswachsen der Zellen verändert.

Protocol

Die Haut Stanzbiopsie unter Verwendung Standardverfahren 3 (zB mit 4mm lang Visipunch Instrument erhalten) sollten in komplettem DMEM 20% FBS Medien auf Eis gehalten werden. Nachdem die Probe im Labor angekommen, verarbeiten die Biopsie so schnell wie möglich. 1. Vorbereitung der Haut Stanzbiopsie STEPS 1,1-1,3 SIND IN EINEM Biosicherheitswerkbank DURCHZUFÜHRENDEN Bereiten Sie im Voraus: In 1 ml 0,1% Gelatine in j…

Representative Results

Keratinozyten wachsen aus der Biopsie Stücke, sobald 48 Stunden nach der Sektion. Erste Fibroblasten Auswuchs kann etwa eine Woche nach der Verarbeitung zu beachten. Sobald die Brunnen Konfluenz erreicht haben, sind Fibroblasten für zwei weitere Passagen passagiert zu drei 150 cm Kolben (T150) zu erreichen und die Zellen werden kryokonserviert. Wir erzeugen mit dieser Methode 15-20 Millionen Zellen. Die Fibroblasten sind für anti-SERPINH1 (auch als HSP-47 bekannt) (Abbildung 1), die ein Kollagen-spez…

Discussion

Mit diesem Protokoll kann relativ reine Kulturen von Fibroblasten gewonnen werden. Die Fibroblasten weisen charakteristische morphologische Merkmale von langgestreckten, spindelförmigen Zellkörper, runde bis ovale Zellkerne und die Fibroblasten wachsen ausgerichtet und in Bündeln, wenn konfluent. Das Medium unterstützt das Wachstum von Fibroblasten während andere Zellpopulationen zB Keratinozyten benötigen Zusatzgebühren und Wachstumsfaktoren oder sind mitotisch weniger aktiv, ermöglicht dies eine relat…

Materials

Name of Equipment	Company	Catalogue Number
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163

Table B. Reagents.