Die Fibroblasten Explantatkultur Protokoll aus der menschlichen Haut Stanzbiopsien ist eine technisch robuste und einfache Weise abzuleiten Hautzellen innerhalb von 4-8 Wochen für Banken von etwa 15-20 Millionen Zellen auf einem niedrigen Durchgang Nummer.
Geweben und Zelllinien von einem Individuum mit der Krankheit abgeleitet sind eine ideale Quelle zu krankheitsbedingten zellulären Phänotypen zu studieren. Patienten stammenden Fibroblasten in diesem Protokoll wurden erfolgreich in der Ableitung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu modellieren Krankheit 1 verwendet. Frühen Passagen dieser Fibroblasten können auch zellbasierten funktionellen Assays verwendet werden, um spezifische Krankheitsbahnen Mechanismen 2 und nachfolgende Wirkstoff-Screening-Ansätzen zu studieren. Der Vorteil der vorgestellten Protokoll über enzymatische Verfahren sind 1) die Reproduzierbarkeit der Technik von kleinen Mengen von Gewebe von älteren Patienten, zB Patienten mit Parkinson-Krankheit, 2 betroffen) der technisch einfachen Ansatz über schwierigere Methoden mittels enzymatischer Behandlungen abgeleitet und 3 ) die Zeit berücksichtigt: Dieses Protokoll dauert 15-20 min und kann sofort nach der Ankunft Biopsie durchgeführt werden. Enzymatische Behandlungen kann bis zu 4 Stunden und haben die Probleme deroverdigestion, Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen und die anschließende Befestigung der Zellen, wenn sie nicht richtig gehandhabt. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation und Herstellung einer 4-mm menschlichen Hautbiopsie zur Ableitung eines Fibroblasten-Kultur und hat eine sehr hohe Erfolgsquote, die wichtig ist, wenn man mit einem Patienten abgeleitete Gewebeproben. In dieser Kultur, Migration Keratinozyten aus der Biopsie Gewebe innerhalb der ersten Woche nach der Zubereitung. Fibroblasten erscheinen 7-10 Tage nach der ersten Folge von Keratinozyten. DMEM high glucose Medium mit 20% FBS begünstigt das Wachstum von Fibroblasten in Keratinozyten und Fibroblasten werden die Keratinozyten überwuchern. Nach 2 Passagen Keratinozyten wurden durchgeführt, was zu relativ homogenen Fibroblastenkulturen die die Fibroblasten-Marker SERPINH1 (HSP-47) drückt verdünnt. Mit diesem Ansatz können 15-20 Millionen Fibroblasten in 4-8 Wochen für die Zell-Banking abgeleitet werden. Die Haut Präparation dauert etwa 15-20 min werden die Zellen dann überwacht einmal täglichunter dem Mikroskop und Medien alle 2-3 Tage nach der Befestigung und Auswachsen der Zellen verändert.
Mit diesem Protokoll kann relativ reine Kulturen von Fibroblasten gewonnen werden. Die Fibroblasten weisen charakteristische morphologische Merkmale von langgestreckten, spindelförmigen Zellkörper, runde bis ovale Zellkerne und die Fibroblasten wachsen ausgerichtet und in Bündeln, wenn konfluent. Das Medium unterstützt das Wachstum von Fibroblasten während andere Zellpopulationen zB Keratinozyten benötigen Zusatzgebühren und Wachstumsfaktoren oder sind mitotisch weniger aktiv, ermöglicht dies eine relat…
The authors have nothing to disclose.
Die Entwicklung dieses Protokoll wurde von der California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) und Parkinson Allianz finanziert.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
Dissecting microscope | Leica | S6E |
10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
Sterile pointed-tip forceps | ||
50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.