Piel biopsia en sacabocados explante cultura para Derivación de fibroblastos humanos primarios
Summary
El explante protocolo de cultivo de fibroblastos humanos de biopsias punch de piel es una manera técnicamente robusta y sencilla de obtener células de la piel dentro de 4-8 semanas para la banca de unos 15-20 millones de células en un número bajo pasaje.
Abstract
Los tejidos y líneas celulares derivadas de un individuo con la enfermedad son fuentes ideales para estudiar los fenotipos celulares relacionados con la enfermedad. Fibroblastos derivados de los pacientes en este protocolo se han utilizado con éxito en la obtención de células madre pluripotentes inducidas a la enfermedad modelo 1. Los primeros pasajes de estos fibroblastos también se pueden utilizar para los ensayos funcionales basados en células para estudiar las vías específicas de la enfermedad, los mecanismos y 2 posteriores enfoques de detección de drogas. La ventaja de la presentada protocolo a través de procedimientos enzimáticos son 1) la reproducibilidad de la técnica a partir de pequeñas cantidades de tejido derivados de pacientes de más edad, por ejemplo, pacientes afectados con la enfermedad de Parkinson, 2) el enfoque técnicamente simple a través de metodologías más desafiantes utilizando tratamientos enzimáticos, y 3 ) la consideración de tiempo: este protocolo toma 15-20 minutos y se puede realizar inmediatamente después de la biopsia de llegada. Tratamientos enzimáticos pueden tardar hasta 4 horas y tienen los problemas deoverdigestion, la reducción de la viabilidad celular y la posterior unión de las células cuando no se manejan adecuadamente. Este protocolo describe la disección y preparación de una piel humana biopsia de 4 mm para la derivación de un cultivo de fibroblastos y tiene una muy alta tasa de éxito que es importante cuando se trata de muestras de tejidos derivados del paciente. En esta cultura, los queratinocitos migran fuera del tejido de la biopsia en la primera semana después de su preparación. Los fibroblastos aparecen 7-10 días después de la primera derivación de los queratinocitos. Medio DMEM rico en glucosa suplementado con 20% de FBS favorece el crecimiento de los fibroblastos sobre los queratinocitos y los fibroblastos se cubran los queratinocitos. Después de 2 pasajes queratinocitos se han diluido a lo que resulta en cultivos de fibroblastos relativamente homogéneos que expresa el marcador de fibroblastos SERPINH1 (HSP-47). Con este enfoque, 15-20000000 fibroblastos pueden derivar en 4-8 semanas para la banca móvil. La disección de la piel dura aproximadamente 15-20 minutos, las células se siguen de cerca una vez al díabajo el microscopio, y los medios de comunicación se cambió cada 2-3 días después de la unión y el crecimiento externo de las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con este protocolo, se pueden obtener las culturas relativamente puras de fibroblastos de la piel. Los fibroblastos tienen rasgos morfológicos característicos de cuerpos de células fusiformes alargadas, redondas para núcleos de las células ovales, y los fibroblastos crecen alineados y en haces cuando confluente. Los medios de comunicación favorece el crecimiento de los fibroblastos, mientras que otras poblaciones celulares por ejemplo, queratinocitos necesitan complementos adicionales y factores de crecim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo de este protocolo fue financiado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM, TR1-01246) y de Parkinson Alliance.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
References
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