Peau biopsie explantation Culture pour la dérivation de fibroblastes humains primaires
Summary
Le protocole de culture d'explants de fibroblastes humains à partir de biopsies de perforation de la peau est une façon techniquement robuste et simple à dériver des cellules de la peau dans les 4-8 semaines pour la banque d'environ 15-20 millions de cellules dans un certain nombre de passage faible.
Abstract
Les tissus et des lignées cellulaires dérivées d'un individu avec la maladie sont des sources idéales pour étudier les phénotypes cellulaires liés à la maladie. Fibroblastes provenant de patients dans ce protocole ont été utilisées avec succès dans l'obtention de cellules souches pluripotentes induites à la maladie de modèle 1. Les premiers passages de ces fibroblastes peuvent également être utilisés pour des tests fonctionnels à base de cellules pour étudier les voies spécifiques de la maladie, les mécanismes et les approches 2 ultérieures de dépistage de drogues. L'avantage du protocole présenté sur les procédures enzymatiques sont 1) la reproductibilité de la technique à partir de petites quantités de tissu provenant de patients âgés, par exemple des patients atteints de la maladie de Parkinson, 2) L'approche techniquement simple sur des méthodologies plus complexes en utilisant des traitements enzymatiques, et 3 ) la prise en compte du temps: ce protocole prend 15-20 minutes et peut être effectuée immédiatement après la biopsie arrivée. Traitements enzymatiques peuvent prendre jusqu'à 4 heures et ont des problèmes dedigestion excessive, la réduction de la viabilité cellulaire et la fixation ultérieure de cellules non traitées correctement. Ce protocole décrit la dissection et la préparation d'une peau humaine 4 mm biopsie pour la dérivation d'une culture de fibroblastes et a un taux de réussite très élevé qui est important dans le cas des échantillons de tissus provenant de patients. Dans cette culture, les kératinocytes migrent hors de la biopsie dans la première semaine après sa préparation. Fibroblastes apparaissent 7-10 jours après la première excroissance des kératinocytes. Médias élevés de glucose DMEM supplémenté avec 20% de FBS favorise la croissance des fibroblastes sur kératinocytes et fibroblastes va envahir les kératinocytes. Après 2 passages kératinocytes ont été dilués en résultant dans des cultures de fibroblastes relativement homogènes qui expriment le marqueur SERPINH1 de fibroblastes (HSP-47). En utilisant cette approche, 15-20 millions fibroblastes peuvent être obtenues dans 4-8 semaines pour les banques de cellules. La dissection de la peau prend environ 15-20 min, les cellules sont ensuite contrôlés une fois par joursous le microscope, et les médias est changée tous les 2-3 jours après la fixation et excroissance de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec ce protocole, les cultures relativement pures de fibroblastes de la peau peuvent être obtenues. Les fibroblastes ont des caractéristiques morphologiques caractéristiques des corps cellulaires, broche en forme allongées, rondes à noyaux des cellules ovales, et les fibroblastes se développent alignés et en paquets lorsque confluent. Les médias favorise la croissance des fibroblastes alors que d'autres populations de cellules kératinocytes par exemple besoin de suppléments additionnels et les fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'élaboration de ce protocole a été financé par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) et de Parkinson Alliance.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson’s disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson’s Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
