Skin Punch Biopsi Eksplantering Kultur for Utledning av primære humane fibroblaster

Summary

Den fibroblast explant kultur protokoll fra human hud slag biopsier er en teknisk robust og enkel måte for å utlede hudceller innen 4-8 uker for banking av ca 15-20 millioner celler ved en lav passasje nummer.

Abstract

Vev og cellelinjer som stammer fra en person med sykdommen er ideelle kilder for å studere sykdomsrelaterte cellulære fenotyper. Pasient-avledet fibroblaster i denne protokollen har blitt brukt i avledning av induserte pluripotente stamceller til modell sykdom ^1. Tidlige passasjer i disse fibroblaster kan også brukes for celle-baserte funksjonelle analyser for å studere bestemte sykdom trasé, mekanismer ² og påfølgende drug screening tilnærminger. Fordelen med den presenterte protokollen over enzymatiske prosedyrer er 1) at reproduserbarheten av teknikken fra små mengder vev avledet fra eldre pasienter, for eksempel pasienter som lider av Parkinsons sykdom, 2) den teknisk enkel tilnærmingen over mer krevende metoder ved hjelp av enzymatiske behandlinger, og tre ) tiden betraktning: denne protokollen tar 15-20 min og kan utføres umiddelbart etter biopsi ankomst. Enzymatiske behandlinger kan ta opp til 4 timer, og har problemene medoverdigestion, reduksjon av cellenes levedyktighet og påfølgende binding av cellene når de ikke behandles på riktig måte. Denne protokollen beskriver disseksjon og utarbeidelse av et 4-mm menneskelig hud biopsi for avledning av en fibroblast kultur og har en svært høy suksessrate som er viktig når du arbeider med pasient-avledet vevsprøver. I denne kulturen, keratinocytter migrere ut av vevsprøver løpet av den første uke etter fremstilling. Fibroblaster vises 7-10 dager etter den første utvekst av keratinocytter. DMEM høy glukose media supplert med 20% FBS favoriserer veksten av fibroblaster løpet keratinocytter og fibroblaster vil overgrow keratinocytter. Etter to passasjer keratinocytes har blitt utvannet ut som resulterer i relativt homogene fibroblastkulturer som uttrykker fibroblast markør SERPINH1 (HSP-47). Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan 15 til 20 millioner fibroblaster utledes i 4-8 uker for cellen banktjenester. Huden disseksjon tar omtrent 15-20 minutter, blir cellene deretter fulgt en gang om dagenunder mikroskopet, og media er endret etter 2-3 dager etter tilknytning og utvekst av celler.

Protocol

Huden punch biopsi innhentet ved hjelp av standard prosedyre 3 (dvs. oppnådd med 4mm runde Visipunch instrument) bør holdes i fullstendig DMEM 20% FBS media på is. Når prøven er ankommet i laboratoriet, behandle biopsi så snart som mulig. En. Klargjøring av Skin Punch Biopsi TRINN 01.01 til 01.03 skal utføres inne i en biosikkerhet CABINET Forbered på forhånd: Tilsett 1 ml 0,1% Gelatin til hver brønn i en…

Representative Results

Keratinocytter vokser ut av biopsi stykker så snart 48 timer etter disseksjon. Først fibroblaster utvekst kan observeres om en uke etter behandling. Når brønnene har nådd confluency, er fibroblaster passaged for to passeringer å nå tre 150 cm kolber (T150) og cellene blir cryopreserved. Vi generere med denne metoden 15 til 20 millioner celler. Den fibroblaster er positive for anti-SERPINH1 (også kjent som HSP-47) (figur 1), som er en kollagen-spesifikk molekylærprobe anstand lokalisert i det en…

Discussion

Med denne protokollen, kan relativt rene kulturer av hudfibroblaster oppnås. Fibroblaster har karakteristiske morfologiske trekk ved langstrakte, spindel-lignende celle organer, runde til ovale cellekjerner, og fibroblaster vokse justert og i bunter når konfluent. Mediene støtter veksten av fibroblaster, mens andre celle populasjoner f.eks keratinocytes trenger ekstra tilskudd og vekstfaktorer, eller er mitotisk mindre aktive, gjør dette for relativt rene fibroblastkulturer.

Fib…

Materials

Name of Equipment	Company	Catalogue Number
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163

Table B. Reagents.