प्राथमिक मानव fibroblasts की व्युत्पत्ति के लिए त्वचा पंच बायोप्सी explant संस्कृति
Summary
मानव त्वचा पंच बायोप्सी से तंतुप्रसू explant संस्कृति प्रोटोकॉल एक कम बीतने संख्या में दस लाख के बारे में 15-20 कोशिकाओं की बैंकिंग के लिए 4-8 सप्ताह के भीतर त्वचा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक तकनीकी रूप से मजबूत और आसान तरीका है.
Abstract
रोग के साथ एक व्यक्ति से ली गई ऊतकों और सेल लाइनों रोग से संबंधित सेलुलर phenotypes अध्ययन करने के लिए आदर्श स्रोत हैं. इस प्रोटोकॉल में रोगी व्युत्पन्न fibroblasts के सफलतापूर्वक मॉडल रोग 1 से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की व्युत्पत्ति में इस्तेमाल किया गया है. इन fibroblasts की प्रारंभिक अंश भी विशिष्ट बीमारी रास्ते, तंत्र 2 और बाद में दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए सेल आधारित कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एंजाइमी प्रक्रियाओं पर प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लाभ 1) एंजाइमी उपचार का उपयोग पुराने रोगियों, पार्किंसंस रोग, 2 के साथ प्रभावित जैसे रोगियों) अधिक चुनौतीपूर्ण तरीके से अधिक तकनीकी रूप से सरल दृष्टिकोण से व्युत्पन्न ऊतक की छोटी मात्रा से तकनीक के reproducibility, और 3 रहे हैं ) समय ध्यान: इस प्रोटोकॉल 15-20 मिनट लगते हैं और बायोप्सी आने के बाद तुरंत किया जा सकता है. Enzymatic उपचार 4 घंटे तक का समय लग और की समस्या हो सकती हैसेल व्यवहार्यता और ठीक से संभाला नहीं जब कोशिकाओं के बाद कुर्की की overdigestion, कमी. इस प्रोटोकॉल में एक 4 मिमी मानव त्वचा एक तंतुप्रसू संस्कृति की व्युत्पत्ति के लिए बायोप्सी के विच्छेदन और तैयारी का वर्णन करता है और रोगी व्युत्पन्न ऊतक के नमूने से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है जो एक बहुत ही उच्च सफलता दर है. इस संस्कृति में, केरेटिनकोशिकाओं तैयारी के बाद पहले सप्ताह के भीतर बायोप्सी ऊतक से बाहर पलायन. Fibroblasts keratinocytes के पहले परिणाम के 7-10 दिन बाद दिखाई देते हैं. 20% FBS के साथ पूरक DMEM उच्च ग्लूकोज मीडिया केरेटिनकोशिकाओं और fibroblasts अधिक fibroblasts की वृद्धि केरेटिनकोशिकाओं बढ़ना होगा पक्ष में है. 2 मार्ग के बाद केरेटिनकोशिकाओं तंतुप्रसू मार्कर SERPINH1 (HSP-47) को व्यक्त करता है जो अपेक्षाकृत समरूप तंतुप्रसू संस्कृतियों में जिसके परिणामस्वरूप बाहर पतला कर दिया गया है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, 15-20000000 fibroblasts सेल बैंकिंग के लिए 4-8 सप्ताह में प्राप्त किया जा सकता है. त्वचा विच्छेदन 15-20 मिनट का समय लगता है, कोशिकाओं तो एक दिन में एक बार निगरानी कर रहे हैंखुर्दबीन के नीचे, और मीडिया हर 2-3 दिनों लगाव और कोशिकाओं के परिणाम के बाद बदल गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के साथ, त्वचा fibroblasts की अपेक्षाकृत शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त किया जा सकता है. fibroblasts के अंडाकार सेल नाभिक को दौर लम्बी, धुरी की तरह सेल निकायों की विशेषता रूपात्मक विशेषताएं हैं, और जब मिला हुआ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोटोकॉल के विकास पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम, TR1-01246) और पार्किंसंस गठबंधन द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
References
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- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
