Den fibroblast explant kultur protokoll fra human hud slag biopsier er en teknisk robust og enkel måte for å utlede hudceller innen 4-8 uker for banking av ca 15-20 millioner celler ved en lav passasje nummer.
Vev og cellelinjer som stammer fra en person med sykdommen er ideelle kilder for å studere sykdomsrelaterte cellulære fenotyper. Pasient-avledet fibroblaster i denne protokollen har blitt brukt i avledning av induserte pluripotente stamceller til modell sykdom 1. Tidlige passasjer i disse fibroblaster kan også brukes for celle-baserte funksjonelle analyser for å studere bestemte sykdom trasé, mekanismer 2 og påfølgende drug screening tilnærminger. Fordelen med den presenterte protokollen over enzymatiske prosedyrer er 1) at reproduserbarheten av teknikken fra små mengder vev avledet fra eldre pasienter, for eksempel pasienter som lider av Parkinsons sykdom, 2) den teknisk enkel tilnærmingen over mer krevende metoder ved hjelp av enzymatiske behandlinger, og tre ) tiden betraktning: denne protokollen tar 15-20 min og kan utføres umiddelbart etter biopsi ankomst. Enzymatiske behandlinger kan ta opp til 4 timer, og har problemene medoverdigestion, reduksjon av cellenes levedyktighet og påfølgende binding av cellene når de ikke behandles på riktig måte. Denne protokollen beskriver disseksjon og utarbeidelse av et 4-mm menneskelig hud biopsi for avledning av en fibroblast kultur og har en svært høy suksessrate som er viktig når du arbeider med pasient-avledet vevsprøver. I denne kulturen, keratinocytter migrere ut av vevsprøver løpet av den første uke etter fremstilling. Fibroblaster vises 7-10 dager etter den første utvekst av keratinocytter. DMEM høy glukose media supplert med 20% FBS favoriserer veksten av fibroblaster løpet keratinocytter og fibroblaster vil overgrow keratinocytter. Etter to passasjer keratinocytes har blitt utvannet ut som resulterer i relativt homogene fibroblastkulturer som uttrykker fibroblast markør SERPINH1 (HSP-47). Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan 15 til 20 millioner fibroblaster utledes i 4-8 uker for cellen banktjenester. Huden disseksjon tar omtrent 15-20 minutter, blir cellene deretter fulgt en gang om dagenunder mikroskopet, og media er endret etter 2-3 dager etter tilknytning og utvekst av celler.
Med denne protokollen, kan relativt rene kulturer av hudfibroblaster oppnås. Fibroblaster har karakteristiske morfologiske trekk ved langstrakte, spindel-lignende celle organer, runde til ovale cellekjerner, og fibroblaster vokse justert og i bunter når konfluent. Mediene støtter veksten av fibroblaster, mens andre celle populasjoner f.eks keratinocytes trenger ekstra tilskudd og vekstfaktorer, eller er mitotisk mindre aktive, gjør dette for relativt rene fibroblastkulturer.
Fib…
The authors have nothing to disclose.
Utvikling av denne protokollen ble finansiert av California Institute for regenerativ medisin (CIRM, TR1-01246) og Parkinsons Alliance.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
Dissecting microscope | Leica | S6E |
10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
Sterile pointed-tip forceps | ||
50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.