Skin stansbiopsi Explantationsersättning Kultur för Derivering av primära humana fibroblaster
Summary
Den fibroblaster Explantation kultur protokollet från humana biopsier huden punch är en tekniskt robust och enkelt sätt att härleda hudceller inom 4-8 veckor för bank på ca 15-20 miljoner celler på en låg passage nummer.
Abstract
Vävnader och cellinjer som härrör från en individ med sjukdomen är perfekta källor för att studera sjukdomsrelaterade cellulära fenotyper. Patient-härledda fibroblaster i detta protokoll har framgångsrikt använts vid härledningen av inducerade pluripotenta stamceller till modellen sjukdom 1. Tidiga passager av dessa fibroblaster kan också användas för cellbaserade funktionella analyser för att studera specifika sjukdomsmekanismer, mekanismer 2 och efterföljande terapier strategier screening. Fördelen med den presenterade protokoll över enzymatiska förfaranden 1) reproducerbarhet av tekniken från små mängder av vävnad som härrör från äldre patienter, t.ex. patienter som drabbats med Parkinsons sjukdom, 2) den tekniskt enkel metod över mer utmanande metoder använder enzymatiska behandlingar, och 3 ) den tid beaktas: detta protokoll tar 15-20 minuter och kan utföras omedelbart efter biopsi ankomst. Enzymatiska behandlingar kan ta upp till fyra timmar och har problemen medoverdigestion, minskning av cellernas livskraft och efterföljande fastsättning av celler när de inte hanteras på rätt sätt. Detta protokoll beskriver dissekering och beredningen av ett 4-mm human hudbiopsi för härledning av en fibroblast kultur och har en mycket stor framgång, som är viktigt när det handlar om patienter-härledde vävnadsprover. I denna kultur, keratinocyter migrerar ut från biopsivävnad inom den första veckan efter beredning. Fibroblaster visas 7-10 dagar efter första utväxt av keratinocyter. DMEM höga glukos-medium kompletterat med 20% FBS gynnar tillväxten av fibroblaster över keratinocyter och fibroblaster kommer växa över de keratinocyter. Efter 2 passager keratinocyter har spätts ut vilket resulterar i relativt homogena fibroblastkulturer som uttrycker SERPINH1 fibroblast markör (HSP-47). Med denna metod kan ca 15-20 miljoner fibroblaster härledas i 4-8 veckor för cell banking. Huden dissektion tar ca 15-20 min, celler övervakas därefter en gång om dagenunder mikroskop, och media byts var 2-3 dagar efter fastsättning och utväxt av celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med detta protokoll kan relativt rena kulturer av hudfibroblaster erhållas. Fibroblasterna har karakteristiska morfologiska drag av långsträckta, spindel-liknande cell organ, runda till ovala cellkärnor, och fibroblaster växer i linje och i buntar när sammanflytande. Medierna stöder tillväxten av fibroblaster medan andra cellpopulationer ex keratinocyter behöver ytterligare tillskott och tillväxtfaktorer, eller är mitotiskt mindre aktiva, gör detta för relativt rena fibroblastkulturer.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utvecklingen av detta protokoll har finansierats av California Institute för regenerativ medicin (CIRM, TR1-01246) och Parkinsons Alliance.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson’s disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson’s Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
