Simple mikrofluidenheder for<em> In vivo</em> Scanning af<em> C. elegans</em>,<em> Drosophila</em> Og zebrafisk
Summary
En simpel mikrofluid enhed er udviklet til at udføre bedøvelse free<em> In vivo</em> Billeddannelse af<em> C. elegans</em>, Intakt<em> Drosophila</em> Larver og zebrafisk larver. Enheden benytter en deformerbar PDMS membran til at immobilisere disse modelorganismer for at udføre tid bortfalder billeddannelse af mange forskellige processer, såsom puls, celledeling og subcellulært neuronal transport. Vi demonstrerer brugen af denne enhed og viser eksempler på forskellige typer af data indsamlet fra forskellige modelsystemer.
Abstract
Micro fabrikerede strømningstekniske giver et tilgængeligt mikro-miljø for in vivo undersøgelser af små organismer. Simple fremstillingsprocesser er tilgængelige for mikrofluide enheder ved hjælp af bløde litografiteknikker 1-3. Mikrofluide anordninger er blevet anvendt til subcellulære billeddannelse 4,5, in vivo laser mikrokirurgi 2,6 og cellulær billeddannelse 4,7. In vivo-billeddannelse kræver immobilisering af organismer. Dette er opnået ved hjælp af sugning 5,8, tilspidsede kanaler 6,7,9, deformerbare membraner 2-4,10, suge med yderligere afkøling 5, bedøvende gas 11, temperaturfølsomme geler 12, cyanoacrylat lim 13 og anæstetika, såsom levamisol 14 , 15. Almindeligt anvendte anæstetika indflydelse synaptisk transmission 16,17 og er kendt for at have skadelige virkninger for sub-cellulær neuronal transport 4. I denne study vi påvise en membran baseret poly-dimethyl-siloxan (PDMS) enhed, der tillader anæstetisk fri immobilisering af intakte genetiske modelorganismer såsom Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila-larver og zebrafisk larver. Disse modelorganismer er egnet til in vivo-undersøgelser i mikrofluidenheder på grund af deres små diametre og optisk transparente eller translucente organer. Organ diametre i området fra ~ 10 um til ~ 800 um for tidlige larvestadier af C. elegans og zebrafisk larver og kræver mikrofluidenheder af forskellig størrelse for at opnå fuldstændig immobilisering for høj opløsning time-lapse billeddannelse. Disse organismer er immobiliseret ved hjælp af tryk fra komprimeret nitrogengas gennem en væskesøjle og afbildet under anvendelse af et omvendt mikroskop. Dyr frigives fra fælden vende tilbage til normal locomotion indenfor 10 min.
Vi viser fire ansøgninger om time-lapse imaging i C. elegansnemlig imaging mitokondriel transport i neuroner, præ-synaptisk vesikel transport i en transport-defekt mutant, glutamat receptor transport og Q neuroblast celledeling. Data opnået fra sådanne film viser, at mikrofluid immobilisering er et nyttigt og præcise middel til at opnå in vivo data af cellulære og subcellulære begivenheder sammenlignet med bedøvede dyr (fig. 1J og 3C-F 4).
Enhedens dimensioner blev ændret for at give tid-lapse imaging af forskellige stadier af C. elegans, første stadium Drosophila larver og zebrafisk larver. Transport af vesikler markeret med synaptotagmin mærket med GFP (syt.eGFP) i sensoriske neuroner viser rettet bevægelse af synaptiske vesikel markører udtrykt i cholinerge sensoriske neuroner i intakt 1:a stadie Drosophila larver. En lignende indretning er blevet anvendt til at udføre time-lapse billeddannelse af hjerteslag i ~ 30 timer efter befrugtning (HPF)zebrafisk larver. Disse data viser, at de simple indretninger vi har udviklet, kan anvendes til en række forskellige modelsystemer til at studere adskillige cellebiologiske og udviklingsmæssige fænomener in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS mikrofluidenheder er optisk transparent derfor kan anvendes til høj opløsning in vivo-afbildning af en transparent / translucent model organisme. Vores design er egnet til stor forstørrelse spatio-temporale billeddannelse af cellulære og subcellulære begivenheder i intakte levende dyr. Microfabrication med bløde litografiteknikker tillader nem manipulation af enhedens dimensioner for forskellige størrelser af modelorganismer. Indretninger af forskellige størrelser, fremstilles til forskellige C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Krishanu Ray til Drosophila aktier, Tarjani Agarwal for at opretholde en Drosophila bur, Peter Juo for nuIs25 og CGC for C. elegans stammer. SPK lavet jsIs609 i Michael Nonet laboratorium. Vi takker Arpan Agnihotri (BITS Pilani) for hans hjælp i time-lapse imaging af mitokondrier transport af jsIs609 dyr i mikrofluidenheder. Vi er taknemmelige for Dr. Vatsala Thirumalai og Surya Prakash for at forsyne os med zebrafisk embryoner. Vi takker Dr. Krishna og CIFF på NCB'erne til brug af spinning disc konfokal mikroskop støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi-Centre for nanoteknologi (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi takker også Kaustubh Rau, V. Venkatraman og Chetana Sachidanand for drøftelserne. Dette arbejde blev finansieret af DBT postdoktoralt stipendium (SM), DST fast-track ordning (SM) og en DBT tilskud til (SPK). SA blev støttet af DST og CSIR tilskud til SPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
- Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
- Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
- Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
- Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
- Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
- Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
