En simpel mikrofluid enhed er udviklet til at udføre bedøvelse free<em> In vivo</em> Billeddannelse af<em> C. elegans</em>, Intakt<em> Drosophila</em> Larver og zebrafisk larver. Enheden benytter en deformerbar PDMS membran til at immobilisere disse modelorganismer for at udføre tid bortfalder billeddannelse af mange forskellige processer, såsom puls, celledeling og subcellulært neuronal transport. Vi demonstrerer brugen af denne enhed og viser eksempler på forskellige typer af data indsamlet fra forskellige modelsystemer.
Micro fabrikerede strømningstekniske giver et tilgængeligt mikro-miljø for in vivo undersøgelser af små organismer. Simple fremstillingsprocesser er tilgængelige for mikrofluide enheder ved hjælp af bløde litografiteknikker 1-3. Mikrofluide anordninger er blevet anvendt til subcellulære billeddannelse 4,5, in vivo laser mikrokirurgi 2,6 og cellulær billeddannelse 4,7. In vivo-billeddannelse kræver immobilisering af organismer. Dette er opnået ved hjælp af sugning 5,8, tilspidsede kanaler 6,7,9, deformerbare membraner 2-4,10, suge med yderligere afkøling 5, bedøvende gas 11, temperaturfølsomme geler 12, cyanoacrylat lim 13 og anæstetika, såsom levamisol 14 , 15. Almindeligt anvendte anæstetika indflydelse synaptisk transmission 16,17 og er kendt for at have skadelige virkninger for sub-cellulær neuronal transport 4. I denne study vi påvise en membran baseret poly-dimethyl-siloxan (PDMS) enhed, der tillader anæstetisk fri immobilisering af intakte genetiske modelorganismer såsom Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila-larver og zebrafisk larver. Disse modelorganismer er egnet til in vivo-undersøgelser i mikrofluidenheder på grund af deres små diametre og optisk transparente eller translucente organer. Organ diametre i området fra ~ 10 um til ~ 800 um for tidlige larvestadier af C. elegans og zebrafisk larver og kræver mikrofluidenheder af forskellig størrelse for at opnå fuldstændig immobilisering for høj opløsning time-lapse billeddannelse. Disse organismer er immobiliseret ved hjælp af tryk fra komprimeret nitrogengas gennem en væskesøjle og afbildet under anvendelse af et omvendt mikroskop. Dyr frigives fra fælden vende tilbage til normal locomotion indenfor 10 min.
Vi viser fire ansøgninger om time-lapse imaging i C. elegansnemlig imaging mitokondriel transport i neuroner, præ-synaptisk vesikel transport i en transport-defekt mutant, glutamat receptor transport og Q neuroblast celledeling. Data opnået fra sådanne film viser, at mikrofluid immobilisering er et nyttigt og præcise middel til at opnå in vivo data af cellulære og subcellulære begivenheder sammenlignet med bedøvede dyr (fig. 1J og 3C-F 4).
Enhedens dimensioner blev ændret for at give tid-lapse imaging af forskellige stadier af C. elegans, første stadium Drosophila larver og zebrafisk larver. Transport af vesikler markeret med synaptotagmin mærket med GFP (syt.eGFP) i sensoriske neuroner viser rettet bevægelse af synaptiske vesikel markører udtrykt i cholinerge sensoriske neuroner i intakt 1:a stadie Drosophila larver. En lignende indretning er blevet anvendt til at udføre time-lapse billeddannelse af hjerteslag i ~ 30 timer efter befrugtning (HPF)zebrafisk larver. Disse data viser, at de simple indretninger vi har udviklet, kan anvendes til en række forskellige modelsystemer til at studere adskillige cellebiologiske og udviklingsmæssige fænomener in vivo.
PDMS mikrofluidenheder er optisk transparent derfor kan anvendes til høj opløsning in vivo-afbildning af en transparent / translucent model organisme. Vores design er egnet til stor forstørrelse spatio-temporale billeddannelse af cellulære og subcellulære begivenheder i intakte levende dyr. Microfabrication med bløde litografiteknikker tillader nem manipulation af enhedens dimensioner for forskellige størrelser af modelorganismer. Indretninger af forskellige størrelser, fremstilles til forskellige C…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Krishanu Ray til Drosophila aktier, Tarjani Agarwal for at opretholde en Drosophila bur, Peter Juo for nuIs25 og CGC for C. elegans stammer. SPK lavet jsIs609 i Michael Nonet laboratorium. Vi takker Arpan Agnihotri (BITS Pilani) for hans hjælp i time-lapse imaging af mitokondrier transport af jsIs609 dyr i mikrofluidenheder. Vi er taknemmelige for Dr. Vatsala Thirumalai og Surya Prakash for at forsyne os med zebrafisk embryoner. Vi takker Dr. Krishna og CIFF på NCB'erne til brug af spinning disc konfokal mikroskop støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi-Centre for nanoteknologi (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi takker også Kaustubh Rau, V. Venkatraman og Chetana Sachidanand for drøftelserne. Dette arbejde blev finansieret af DBT postdoktoralt stipendium (SM), DST fast-track ordning (SM) og en DBT tilskud til (SPK). SA blev støttet af DST og CSIR tilskud til SPK.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
Developer | Microchem | SU8 Developer | |
Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |