Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre<em> In vivo</em> Formación de imágenes de<em> C. elegans</em>, Intacto<em> Drosophila</em> Larvas y larvas de pez cebra. El dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar estos organismos modelo con el fin de realizar las imágenes de lapso de tiempo de numerosos procesos, tales como el ritmo cardíaco, la división celular y subcelular transporte neuronal. Se demuestra el uso de este dispositivo y muestran ejemplos de diferentes tipos de datos recogidos a partir de sistemas de modelos diferentes.
Micro fabricadas dispositivos fluídicos proporcionar un micro-entorno accesible para estudios in vivo de pequeños organismos. Procesos de fabricación sencillos están disponibles para los dispositivos de microfluidos con técnicas de litografía blanda 1-3. Los dispositivos microfluídicos se han usado para la sub-celular de imagen 4,5, in vivo microcirugía láser 2,6 y 4,7 celular formación de imágenes. Imágenes in vivo requiere la inmovilización de los organismos. Esto se ha logrado mediante succión 5,8, 6,7,9 canales cónicos, membranas deformables 2-4,10, succión con refrigeración adicional 5, anestésico gas 11, geles sensibles a la temperatura 12, 13 y pegamento de cianoacrilato anestésicos tales como levamisol 14 , 15. Anestésicos usados comúnmente influir en la transmisión sináptica 16,17 y se sabe que tienen efectos perjudiciales sobre la sub-celular neuronal transporte 4. En este study demostramos una membrana basada poli-dimetil-siloxano (PDMS), dispositivo que permite la inmovilización anestésico libre de organismos modelo intactas genéticos tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans), larvas de Drosophila y larvas de pez cebra. Estos organismos modelo son adecuados para estudios in vivo en los dispositivos de microfluidos a causa de sus pequeños diámetros y cuerpos ópticamente transparentes o translúcidos. Diámetros del cuerpo van desde ~ 10 ~ 800 micras para micras para los primeros estadios larvales de C. elegans y larvas de pez cebra y requieren dispositivos de microfluidos de diferentes tamaños para lograr una inmovilización completa de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo. Estos organismos se inmovilizan mediante presión aplicada por gas nitrógeno comprimido a través de una columna de líquido y fotografiado usando un microscopio invertido. Animales liberados de la trampa de volver a la locomoción normal dentro de 10 min.
Demostramos cuatro aplicaciones de time-lapse en C. elegansa saber, el transporte mitocondrial de imágenes en las neuronas, presináptica transporte de vesículas en un transporte defectuoso de transporte mutante del receptor de glutamato y la división Q neuroblast celular. Los datos obtenidos de tales películas muestran que la inmovilización de microfluidos es un medio útil y exacta de la adquisición de los datos in vivo de eventos celulares y subcelulares en comparación con los animales anestesiados (Figura 1J y 4 3C-F).
Las dimensiones del dispositivo se han alterado para permitir imágenes a intervalos de tiempo de las diferentes etapas de C. elegans, Drosophila primer instar de larvas y larvas de pez cebra. El transporte de vesículas marcados con sinaptotagmina etiquetado con GFP (syt.eGFP) en las neuronas sensoriales muestra un movimiento dirigido de marcadores vesículas sinápticas colinérgicas expresados en las neuronas sensoriales intactas larvas de primer instar Drosophila. Un dispositivo similar se ha utilizado para llevar a cabo el tiempo de imágenes a intervalos de latido del corazón en ~ 30 horas después de la fertilización (hpf)pez cebra larvas. Estos datos muestran que los dispositivos simples que hemos desarrollado puede ser aplicado a una variedad de sistemas modelo para estudiar varios fenómenos biológicos celulares y de desarrollo in vivo.
PDMS dispositivos microfluídicos son ópticamente transparentes por lo tanto se puede utilizar para la alta resolución en imágenes in vivo de cualquier organismo modelo transparente / translúcido. Nuestro diseño es adecuado para una gran ampliación espacio-temporal de imágenes de eventos celulares y subcelulares de animales vivos intactos. Microfabrication utilizando técnicas litográficas blandas permite la fácil manipulación de las dimensiones del dispositivo para diferentes tamaños de org…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Ray Krishanu para las poblaciones de Drosophila, Tarjani Agarwal para el mantenimiento de una jaula de Drosophila, Peter Juo para nuIs25 CGC y de C. elegans cepas. SPK jsIs609 hecho en el laboratorio de Nonet de Michael. Damos las gracias a Arpan Agnihotri (BITS Pilani) por su ayuda en time-lapse de transporte mitocondrias de los animales jsIs609 en dispositivos de microfluidos. Estamos muy agradecidos con el Dr. Vatsala Thirumalai Surya Prakash y por darnos embriones de pez cebra. Damos las gracias a la Dra. Krishna y CIFF en BCN para uso del microscopio confocal de disco giratorio apoyado por el Departamento de Ciencia y Tecnología-Centro para la Nanotecnología (N º SR/55/NM-36-2005). También damos las gracias Kaustubh Rau, V. y Venkatraman Sachidanand Chetana para los debates. Este trabajo fue financiado por el DBT beca posdoctoral (SM), DST vía rápida esquema (SM) y una subvención a DBT (SPK). SA fue apoyado por becas de horario de verano y el CSIR a SPK.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
Developer | Microchem | SU8 Developer | |
Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |