Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor<em> In vivo</em> Beeldvorming van<em> C. elegans</em>,<em> Drosophila</em> En zebravis
Summary
Een eenvoudige microfluïdische apparaat is ontwikkeld om verdoving gratis uit te voeren<em> In vivo</em> Beeldvorming<em> C. elegans</em>, Intacte<em> Drosophila</em> Larven en zebravis larven. Het apparaat maakt gebruik van een vervormbare PDMS membraan om deze modelorganismen immobiliseren om time-lapse imaging van tal van processen zoals hartslag, celdeling en sub-cellulaire neuronale transport uit te voeren. We demonstreren het gebruik van dit apparaat en tonen voorbeelden van verschillende soorten gegevens uit verschillende modelsystemen.
Abstract
Micro gefabriceerd fluïduminrichtingen zorgen voor een toegankelijke micro-omgeving voor in vivo studies op kleine organismen. Eenvoudige fabricage processen zijn beschikbaar voor microfluïdische apparaten met behulp van zachte lithografie technieken 1-3. Microfluïdische inrichtingen zijn gebruikt voor subcellulaire imaging 4,5, in vivo laser microchirurgie 2,6 en 4,7 cellulaire beeldvorming. In vivo beeldvorming immobilisatie van organismen vereist. Dit is bereikt met zuig 5,8, taps toelopende kanalen 6,7,9, vervormbare membranen 2-4,10, zuig met extra koeling 5, narcosegas 11, temperatuurgevoelige gels 12, 13 en cyanoacrylaatlijm anesthetica zoals levamisole 14 , 15. Veelgebruikte anesthetica synaptische transmissie beïnvloeden 16,17 en is bekend nadelige effecten op subcellulair neuronale transport 4 hebben. In deze stUdy demonstreren we een membraan uit poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) apparaat dat verdoving vrije immobilisatie van intacte genetisch model organismen zoals Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larven en zebravis larven mogelijk. Dit model organismen zijn geschikt voor in vivo studies in microfluïdische inrichtingen vanwege hun kleine diameters en optisch transparant of doorschijnend organen. In diameters van ~ 10 pm tot ~ 800 urn voor vroege larvale stadia van C. elegans en zebravis larven en vereisen microfluïdische apparaten van verschillende afmetingen om volledig te immobiliseren voor hoge resolutie time-lapse imaging bereiken. Deze organismen worden geïmmobiliseerd met behulp van druk van gecomprimeerd stikstofgas door een vloeistofkolom en afgebeeld met een omgekeerde microscoop. Dieren vrijgelaten uit de val terug naar de normale voortbeweging binnen 10 minuten.
We tonen vier toepassingen van time-lapse imaging in C. elegansnamelijk beeldvorming mitochondriaal vervoer in neuronen, pre-synaptische blaasje transport in een transport-defecte mutant, glutamaat receptor transport en Q neuroblast celdeling. Gegevens van dergelijke films laten zien dat microfluïdische immobilisatie is een nuttig en nauwkeurig middel verkrijgen in vivo data van cellulaire en sub-cellulaire gebeurtenissen ten opzichte van verdoofde dieren (Figuur 1J en 3C-F 4).
Afmetingen van het apparaat werden veranderd om time-lapse beeldvorming van de verschillende stadia van C. Laat elegans, eerste instar Drosophila larven en zebravis larven. Transport van blaasjes gemarkeerd met synaptotagmin getagd met GFP (syt.eGFP) in sensorische neuronen toont gerichte beweging van synaptische blaasjes markers uitgedrukt in cholinerge sensorische neuronen in intacte eerste instar Drosophila larven. Een dergelijke inrichting is gebruikt voor het uitvoeren van time-lapse beeldvorming van hartslag in ~ 30 uur na de bevruchting (HPF)zebravis larven. Deze gegevens tonen dat de eenvoudige apparaten we hebben kan op een aantal modelsystemen verschillende celbiologische en ontwikkeling verschijnselen te bestuderen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS microfluïdische inrichtingen zijn optisch transparant kan daarom worden gebruikt voor hoge resolutie in vivo beeldvorming van elke doorzichtige / doorschijnende modelorganisme. Ons ontwerp is geschikt voor een sterke vergroting van spatio-temporele Beeldvorming van cellulaire en sub-cellulaire gebeurtenissen in intacte levende dieren. Microfabricage met behulp van zachte lithografie technieken maakt een eenvoudige manipulatie van het apparaat afmetingen voor verschillende maten van modelorganismen. Inrich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Krishanu Ray voor Drosophila voorraden, Tarjani Agarwal voor het handhaven van een Drosophila kooi, Peter Juo voor nuIs25 en CGC voor C. elegans stammen. SPK gemaakt jsIs609 in het laboratorium van Michael Nonet's. Wij danken Arpan Agnihotri (BITS Pilani) voor zijn hulp bij time-lapse imaging van mitochondriën transport van jsIs609 dieren in microfluïdische apparaten. We zijn dankbaar voor Dr Vatsala Thirumalai en Surya Prakash voor het verstrekken van ons met zebravis embryo's. Wij danken dr. Krishna en CIFF bij de NCB's voor het gebruik van de draaiende schijf confocale microscoop wordt ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie-Centrum voor Nanotechnologie (nr. SR/55/NM-36-2005). We danken ook Kaustubh Rau, V. Venkatraman en Chetana Sachidanand voor discussies. Dit werk werd gefinancierd door de DBT post-doctorale beurs (SM), DST versnelde regeling (SM) en een DBT subsidie (SPK). SA werd ondersteund door DST en CSIR subsidies aan SPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
- Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
- Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
- Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
- Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
- Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
- Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
