عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي
Summary
نوع جديد من بروتين بريون الخلوي (بي ار بي<sup> C</sup>) وقد تم مؤخرا المحددة في العقول البشرية غير مصاب باستخدام الأساليب المذكورة هنا. ويمكن استخدام هذه الأساليب لعزل الأنواع المختلفة بي ار بي، في حين أن بعض من هم من المفيد أيضا في عزل المجاميع الأخرى من البروتين تتجمع العقول البشرية.
Abstract
الحدث المركزي في التسبب في الأمراض البريونية ينطوي على تحويل المضيف ترميز البروتين بي ار بي الخلوية بريون C المسببة للأمراض في شكل الإسوي في بي ار بي SC 1. بي ار بي C هو المنظفات للذوبان وبروتين حساسة للK (PK)-الهضم، في حين تشكل المنظفات بي ار بي برأسية غير قابلة للذوبان المجاميع ومقاومة جزئيا إلى PK 2-6. ومن المعروف أن تحويل C بي ار بي بي ار بي إلى اتفاقية استكهولم لإشراك الانتقال بتكوين لα β-حلزونية لورقة هياكل البروتين. ومع ذلك، لا تزال في مسار الجسم الحي غير مفهومة. A الذاتية مؤقت بي ار بي برأسية والمتوسطة * بي ار بي أو "بريون الصمت"، لم يتم بعد تحديدها في الدماغ غير مصاب 7.
باستخدام مزيج من النهج البيوفيزيائية والكيمياء الحيوية، وحددنا المجاميع غير قابلة للذوبان بي ار بي C (C iPrP المعينة) من أدمغة الثدييات غير مصاب ومثقف الخلايا العصبيةخلايا 8 و 9. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لهذه الأساليب، بما في ذلك في تنبيذ فائق العازلة المنظفات والترسيب السكروز التدرج خطوة، وحجم الإقصاء اللوني، iPrP تخصيب اليورانيوم بحلول البروتين الجيني 5 (g5p) التي تربط خصيصا لأشكال بي ار بي تغيير هيكليا 10، وPK المعاملة. مزيج من هذه الأساليب ليس فقط غير قابلة للذوبان يعزل بي ار بي بي ار بي برأسية والمجاميع C ولكن أيضا للذوبان بي ار بي oligomers C من دماغ الإنسان العادي. منذ بروتوكولات الموصوفة هنا قد استخدمت لعزل كل من بي ار بي برأسية من العقول المصابة وiPrP C من العقول غير مصاب، لأنها توفر لنا فرصة لمقارنة الاختلافات في الميزات الفيزيائية، السمية العصبية، والعدوى بين الأشكال الإسوية اثنين. ومثل هذه الدراسة تحسن كثيرا فهمنا لمسببات الأمراض المعدية والبروتينية. علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للC iPrP غير واضحة في الوقت الحاضر. والجدير بالذكر أن في A-ID حديثاوجدنا entified المرض البريوني البشري ووصف بنسب مختلفة البروتيني حساسة prionopathy، جديد برأسية بي ار بي أن تشارك سلوك متفاعل مناعيا وتجزئة C مع iPrP 11 و 12. وعلاوة على ذلك، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن iPrP C هو أهم الأنواع التي تتفاعل مع بروتين اميلويد β في مرض الزهايمر 13. في نفس الدراسة، تم استخدام هذه الأساليب لعزل المجاميع Abeta وoligomers في مرض الزهايمر 13، مما يدل تطبيقها على المجاميع البروتين غير بريون المشاركة في الاضطرابات العصبية الأخرى.
Protocol
Discussion
مزيج من النهج ذكرت هنا غير قابلة للذوبان يعزل باستمرار بي ار بي المجاميع C وقابل للذوبان oligomers بي ار بي C من دماغ الإنسان العادي. تنبيذ فائق في 100،000 x ج لمدة ساعة واحدة هو أسلوب الكلاسيكية التي استخدمت على نطاق واسع لفصل برأسية غير قابلة للذوبان بي ار ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ال الكتاب ممتنون للدماغ والعمود الفقري الإنسان مركز الموارد الموائع (لوس أنجلوس، CA) لتوفير عينات الدماغ العادي. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01NS062787، ومؤسسة CJD بالأمان البيولوجي، التحالف، فضلا عن مركز جامعة للشيخوخة والصحة بدعم من مؤسسة ماكجريجور وصندوق الرئيس الكمالية (كيس ويسترن ريزرف) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
