نوع جديد من بروتين بريون الخلوي (بي ار بي C) وقد تم مؤخرا المحددة في العقول البشرية غير مصاب باستخدام الأساليب المذكورة هنا. ويمكن استخدام هذه الأساليب لعزل الأنواع المختلفة بي ار بي، في حين أن بعض من هم من المفيد أيضا في عزل المجاميع الأخرى من البروتين تتجمع العقول البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحدث المركزي في التسبب في الأمراض البريونية ينطوي على تحويل المضيف ترميز البروتين بي ار بي الخلوية بريون C المسببة للأمراض في شكل الإسوي في بي ار بي SC 1. بي ار بي C هو المنظفات للذوبان وبروتين حساسة للK (PK)-الهضم، في حين تشكل المنظفات بي ار بي برأسية غير قابلة للذوبان المجاميع ومقاومة جزئيا إلى PK 2-6. ومن المعروف أن تحويل C بي ار بي بي ار بي إلى اتفاقية استكهولم لإشراك الانتقال بتكوين لα β-حلزونية لورقة هياكل البروتين. ومع ذلك، لا تزال في مسار الجسم الحي غير مفهومة. A الذاتية مؤقت بي ار بي برأسية والمتوسطة * بي ار بي أو "بريون الصمت"، لم يتم بعد تحديدها في الدماغ غير مصاب 7.
باستخدام مزيج من النهج البيوفيزيائية والكيمياء الحيوية، وحددنا المجاميع غير قابلة للذوبان بي ار بي C (C iPrP المعينة) من أدمغة الثدييات غير مصاب ومثقف الخلايا العصبيةخلايا 8 و 9. هنا، نحن تصف الإجراءات التفصيلية لهذه الأساليب، بما في ذلك في تنبيذ فائق العازلة المنظفات والترسيب السكروز التدرج خطوة، وحجم الإقصاء اللوني، iPrP تخصيب اليورانيوم بحلول البروتين الجيني 5 (g5p) التي تربط خصيصا لأشكال بي ار بي تغيير هيكليا 10، وPK المعاملة. مزيج من هذه الأساليب ليس فقط غير قابلة للذوبان يعزل بي ار بي بي ار بي برأسية والمجاميع C ولكن أيضا للذوبان بي ار بي oligomers C من دماغ الإنسان العادي. منذ بروتوكولات الموصوفة هنا قد استخدمت لعزل كل من بي ار بي برأسية من العقول المصابة وiPrP C من العقول غير مصاب، لأنها توفر لنا فرصة لمقارنة الاختلافات في الميزات الفيزيائية، السمية العصبية، والعدوى بين الأشكال الإسوية اثنين. ومثل هذه الدراسة تحسن كثيرا فهمنا لمسببات الأمراض المعدية والبروتينية. علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للC iPrP غير واضحة في الوقت الحاضر. والجدير بالذكر أن في A-ID حديثاوجدنا entified المرض البريوني البشري ووصف بنسب مختلفة البروتيني حساسة prionopathy، جديد برأسية بي ار بي أن تشارك سلوك متفاعل مناعيا وتجزئة C مع iPrP 11 و 12. وعلاوة على ذلك، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن iPrP C هو أهم الأنواع التي تتفاعل مع بروتين اميلويد β في مرض الزهايمر 13. في نفس الدراسة، تم استخدام هذه الأساليب لعزل المجاميع Abeta وoligomers في مرض الزهايمر 13، مما يدل تطبيقها على المجاميع البروتين غير بريون المشاركة في الاضطرابات العصبية الأخرى.
البروتوكول
1. إعداد جناسة الدماغ والمنظفات للذوبان (S2) وغير القابلة للذوبان، الكسور (P2)
- تأخذ 100 ملغ المجمدة أنسجة المخ الإنسان وإضافة 100 ميكرولتر العازلة تحلل (10 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.5٪ Nonidet P-40 (NP-40)، EDTA 0.5٪، ودرجة الحموضة 7.4).
- التجانس على الجليد باستخدام مدقة يقودها موتور اللاسلكي، تجميده في الثلج الجاف لمدة 5 دقائق والتجانس باستخدام مدقة مرة أخرى يقودها اليدين أولا ثم من قبل السيارات، وإضافة 300 ميكرولتر العازلة تحلل أو 800 ميكرولتر (هذا هو إما ال 20 ٪ أو 10٪ جناسة ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
مزيج من النهج ذكرت هنا غير قابلة للذوبان يعزل باستمرار بي ار بي المجاميع C وقابل للذوبان oligomers بي ار بي C من دماغ الإنسان العادي. تنبيذ فائق في 100،000 x ج لمدة ساعة واحدة هو أسلوب الكلاسيكية التي استخدمت على نطاق واسع لفصل برأسية غير قابلة للذوبان بي ار بي بي ار بي من ذوبان C 14. في حين أنه من كفاءة، واحدة من يحذر هو تجنب التلوث أثناء سحب طاف (S2) بعد الطرد المركزي. منذ الشخصي هلام من C iPrP يختلف عن ذلك من C ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ال الكتاب ممتنون للدماغ والعمود الفقري الإنسان مركز الموارد الموائع (لوس أنجلوس، CA) لتوفير عينات الدماغ العادي. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01NS062787، ومؤسسة CJD بالأمان البيولوجي، التحالف، فضلا عن مركز جامعة للشيخوخة والصحة بدعم من مؤسسة ماكجريجور وصندوق الرئيس الكمالية (كيس ويسترن ريزرف) .
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
| Phenylmethylsulfonyl فلوريد | سيغما الدريخ | P7626 | 72 مم في بروبانول-2 |
| بروتين K | سيغما الدريخ | P2308 | 2 ملغ / مل في H 2 O |
| PNGase F | نيو انغلاند Biolabs | MWGF200 | |
| LE-80K نابذة فائقة السرعة، SW55 الدوار | بيكمان كولتر | الجزء رقم 365668، 356860 | |
| Superdex 200 HR الخرز | GE للرعاية الصحية | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC النظام | GE للرعاية الصحية | 18-1900-26 | |
| علامات الوزن الجزيئي | سيغما الدريخ | MWGF200 | تباينت |
| Dynabeads M-280 الخرز المغناطيسي | إينفيتروجن | 143-01 | |
| 3F4 الأجسام المضادة | كوفانس | SIG-39600 | |
| 1E4 الأجسام المضادة | خلية العلوم | M1840 | |
| هلام استعداد 15٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك مسبقة الصب المواد الهلامية | بيو راد | 345-0020 |
المراجع
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
