Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal
Summary
Uma nova espécie de proteína príon celular (PrP<sup> C</sup>) Foi recentemente identificada em cérebros humanos não infectadas com os métodos descritos aqui. Estes métodos podem ser utilizados para isolar espécies diferentes de PrP, enquanto alguns deles são também úteis no isolamento de outros agregados de proteínas mal dobradas a partir de cérebros humanos.
Abstract
O evento central na patogénese das doenças provocadas por priões envolve a conversão do hospedeiro celular codificado prião proteína PrP C em sua isoforma patogénica PrP Sc 1. PrP C é solúvel em detergente e sensível à proteinase K (PK)-digestão, enquanto que a PrP Sc detergente forma de agregados insolúveis e é parcialmente resistente a PK 2-6. A conversão da PrP C e PrP Sc é conhecida por envolver a transição conformacional de α-helicoidal para β folhas estruturas da proteína. No entanto, o caminho em vivo ainda é pouco compreendida. A tentativa endógena PrPSc, intermediário * PrP ou "prião silenciosa", ainda tem de ser identificado no cérebro não infectado 7.
Usando uma combinação de abordagens biofísicas e bioquímicas, identificamos agregados insolúveis PrP C (designado iPrP C) a partir de cérebros de mamíferos não infectados e em cultura neuronalcélulas 8, 9. Aqui, descrevemos os procedimentos pormenorizados destes métodos, incluindo ultracentrifugação em tampão detergente, a sedimentação em gradiente escalonado de sacarose, cromatografia de exclusão de tamanho, o enriquecimento iPrP pelo gene da proteína 5 (G5p) que se ligam especificamente a formas de PrP estruturalmente alterados 10 e PK-tratamento. A combinação destas abordagens isolados não apenas insolúvel PrP Sc e agregados PrP C, mas também oligómeros solúveis PrP C a partir do cérebro humano normal. Uma vez que os protocolos aqui descritos foram utilizados para isolar tanto PrPSc de cérebros infectados e C iPrP de cérebros de não infectados, eles dão-nos a oportunidade de comparar as diferenças nas características físico-químicas, neurotoxicidade e infectividade entre as duas isoformas. Tal estudo vai melhorar muito a nossa compreensão dos agentes infecciosos proteicas. A fisiologia e fisiopatologia do iPrP C não são claras no presente. Notavelmente, em recém-iddoença de príon entified humano denominado variável protease-sensível prionopathy, encontramos um novo PrPSc que compartilha o comportamento imunorreativos e fragmentação com iPrP C 11, 12. Além disso, foi recentemente demonstrado que iPrP C é a espécie principal, que interage com a proteína amilóide-β na doença de Alzheimer 13. No mesmo estudo, estes métodos foram usados para isolar os agregados Abeta e oligómeros em doença de Alzheimer, 13, o que sugere a sua aplicação aos agregados de proteína prião não envolvidos em outras doenças neurodegenerativas.
Protocol
Discussion
A combinação de abordagens aqui relatado isola consistentemente agregados insolúveis PrP C e PrP C oligómeros solúveis de cérebro humano normal. Ultracentrifugação a 100.000 xg durante uma hora, é um método clássico que tem sido amplamente utilizado para a separação do insolúvel PrPSc solúvel a partir da PrP C 14. Embora seja eficaz, uma das precauções é evitar a contaminação durante o puxar-se o sobrenadante (S2), após a centrifugação. Uma vez que o per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autores são gratos ao cérebro humano e Centro de Recursos da coluna de líquido (Los Angeles, CA) para fornecer amostras normais do cérebro. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01NS062787, a Fundação CJD, biossegurança Aliança, bem como o Centro Universitário de Envelhecimento e Saúde, com o apoio da Fundação McGregor e Fundo discricionário do Presidente (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
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