Выделение растворимых и нерастворимых олигомеров PrP в нормальном мозга человека
Summary
Новый вид клеточный белок прион (PrP<sup> C</sup>) Недавно была идентифицирована в незараженных человеческого мозга с использованием методов, описанных здесь. Эти методы могут быть использованы для выделения различных видов PrP, а некоторые из них также являются полезными в изоляции других агрегатов неправильно упакованных белков из человеческого мозга.
Abstract
Центральным событием в патогенезе прионных заболеваний включает в себя преобразование хоста в кодировке сотовой прионных белков PrP C в своей патогенной изоформы PrP Sc 1. PrP C является моющим средством растворимых и чувствительны к протеиназы К (PK)-пищеварения, в то время как PrPSc, образует нерастворимые моющих средств агрегатов и частично устойчивы к ПК 2-6. Преобразование PrP C в PrPSc, как известно, связаны с конформационного перехода из α-спиральные к β-лист структуре белка. Тем не менее, в пути естественных условиях все еще плохо изучены. Предварительный эндогенных PrPSc, промежуточные PrP * или "тихая прионных", до сих пор не определены в неинфицированных мозга 7.
Использование комбинации биофизических и биохимических подходов, мы определили нерастворимые PrP C агрегатов (назначенный IPRP C) из неинфицированных млекопитающих мозг и культурный нейроновклетки 8, 9. Здесь мы описываем подробные процедуры из этих методов, в том числе ультрацентрифугирования в моющих буфер, сахарозу шаг градиента осаждение, хроматография исключения, IPRP обогащения гена 5 белков (G5p), которые специфически связываются с структурно изменило PrP формы 10 и ПК-лечение. Сочетание этих подходов изолирует не только нерастворимые PrPSc, и PrP C агрегатов, но и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Так как протоколы, описанные здесь, были использованы для выделения и PrPSc, от инфицированной мозги и IPRP C от неинфицированных мозги, они дают нам возможность сравнить различия в физико-химическими свойствами, нейротоксичность, и инфекционной двух изоформ. Такое исследование позволит значительно улучшить наше понимание инфекционных белковых патогенных микроорганизмов. Физиологии и патофизиологии IPRP C неясны в настоящее время. Примечательно, что в новой ID-entified прионных болезней человека называют переменно-протеазы чувствительной prionopathy, мы нашли новый PrPSc, которая разделяет иммунореактивного поведения и фрагментации с IPRP C 11, 12. Кроме того, недавно мы показали, что IPRP C является основным видом, который взаимодействует с β-амилоидных белков в болезнь Альцгеймера 13. В том же исследовании, эти методы были использованы для выделения Abeta агрегатов и олигомеров при болезни Альцгеймера 13, предполагая, их применение не-прионных белков агрегатов, участвующих в других нейродегенеративных заболеваний.
Protocol
Discussion
Сочетание подходов сообщили здесь изолирует последовательно нерастворимые агрегаты PrP C и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Ультрацентрифугирования при 100000 х г в течение одного часа является классическим методом, который широко используется…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность человеческого мозга и спинного ресурсный центр Fluid (Лос-Анджелес, Калифорния) для обеспечения нормальных образцов мозга. Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) R01NS062787, CJD фонд, Альянс BioSecure, а также центр университета по проблемам старения и здоровья при поддержке МакГрегор фонда и дискреционного фонда Президента (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
