Новый вид клеточный белок прион (PrP<sup> C</sup>) Недавно была идентифицирована в незараженных человеческого мозга с использованием методов, описанных здесь. Эти методы могут быть использованы для выделения различных видов PrP, а некоторые из них также являются полезными в изоляции других агрегатов неправильно упакованных белков из человеческого мозга.
Центральным событием в патогенезе прионных заболеваний включает в себя преобразование хоста в кодировке сотовой прионных белков PrP C в своей патогенной изоформы PrP Sc 1. PrP C является моющим средством растворимых и чувствительны к протеиназы К (PK)-пищеварения, в то время как PrPSc, образует нерастворимые моющих средств агрегатов и частично устойчивы к ПК 2-6. Преобразование PrP C в PrPSc, как известно, связаны с конформационного перехода из α-спиральные к β-лист структуре белка. Тем не менее, в пути естественных условиях все еще плохо изучены. Предварительный эндогенных PrPSc, промежуточные PrP * или "тихая прионных", до сих пор не определены в неинфицированных мозга 7.
Использование комбинации биофизических и биохимических подходов, мы определили нерастворимые PrP C агрегатов (назначенный IPRP C) из неинфицированных млекопитающих мозг и культурный нейроновклетки 8, 9. Здесь мы описываем подробные процедуры из этих методов, в том числе ультрацентрифугирования в моющих буфер, сахарозу шаг градиента осаждение, хроматография исключения, IPRP обогащения гена 5 белков (G5p), которые специфически связываются с структурно изменило PrP формы 10 и ПК-лечение. Сочетание этих подходов изолирует не только нерастворимые PrPSc, и PrP C агрегатов, но и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Так как протоколы, описанные здесь, были использованы для выделения и PrPSc, от инфицированной мозги и IPRP C от неинфицированных мозги, они дают нам возможность сравнить различия в физико-химическими свойствами, нейротоксичность, и инфекционной двух изоформ. Такое исследование позволит значительно улучшить наше понимание инфекционных белковых патогенных микроорганизмов. Физиологии и патофизиологии IPRP C неясны в настоящее время. Примечательно, что в новой ID-entified прионных болезней человека называют переменно-протеазы чувствительной prionopathy, мы нашли новый PrPSc, которая разделяет иммунореактивного поведения и фрагментации с IPRP C 11, 12. Кроме того, недавно мы показали, что IPRP C является основным видом, который взаимодействует с β-амилоидных белков в болезнь Альцгеймера 13. В том же исследовании, эти методы были использованы для выделения Abeta агрегатов и олигомеров при болезни Альцгеймера 13, предполагая, их применение не-прионных белков агрегатов, участвующих в других нейродегенеративных заболеваний.
Сочетание подходов сообщили здесь изолирует последовательно нерастворимые агрегаты PrP C и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Ультрацентрифугирования при 100000 х г в течение одного часа является классическим методом, который широко используется…
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность человеческого мозга и спинного ресурсный центр Fluid (Лос-Анджелес, Калифорния) для обеспечения нормальных образцов мозга. Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) R01NS062787, CJD фонд, Альянс BioSecure, а также центр университета по проблемам старения и здоровья при поддержке МакГрегор фонда и дискреционного фонда Президента (Case Western Reserve University) .
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |