Isolering av oppløselige og uoppløselige PrP oligomerer i Normal Human Brain
Summary
En ny art av mobilnettet prionproteinet (PrP<sup> C</sup>) Har nylig blitt identifisert i friske menneskelige hjerne ved hjelp av metodene som er beskrevet her. Disse metodene kan brukes til å isolere forskjellige PrP arter, mens noen av dem er også nyttige for å isolere andre misfolded protein tilslag fra menneskelige hjerne.
Abstract
Den sentrale begivenhet i patogenesen av prionsykdommer innebærer en konvertering av verten-kodede cellulær prionproteinet PrP C i sin sykdomsfremkallende isoform PrP Sc 1. PrP C er vaskemiddel-løselig og følsom for proteinase K (PK)-fordøyelsen, mens PrP Sc danner vaskemiddel-uoppløselige aggregater og er delvis resistent til PK 2-6. Omdannelsen av PrP C til PrP Sc er kjent for å omfatte en konformasjonsendring overgang av α-spiralformede til β arks strukturer av protein. Imidlertid er in vivo pathway fremdeles dårlig forstått. En foreløpig endogene PrP Sc, middels PrP * eller "silent prion", har ennå ikke identifisert i infisert hjernen 7.
Ved hjelp av en kombinasjon av biofysiske og biokjemiske metoder, identifiserte vi uløselige PrP C aggregater (betegnet iPrP C) fra infiserte pattedyr hjerner og kulturperler neuronalceller 8, 9. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer av disse metoder, inkludert ultrasentrifugering i vaskemiddel buffer, sukrose trinngradient sedimentering, gelfiltrerings-kromatografi, iPrP oppformering etter genet 5 protein (G5p) som spesifikt binder seg til strukturelt endrede PrP skjemaer 10, og PK-behandling. Kombinasjonen av disse metodene isolerer ikke bare uløselig PrP Sc og PrP C tilslag, men også løselig PrP C oligomerer fra normal menneskelig hjerne. Siden protokoller som er beskrevet her har blitt brukt til å isolere både PrP Sc fra infiserte hjerner og iPrP C fra friske hjerner, de gir oss en mulighet til å sammenligne forskjeller i fysisk-kjemiske egenskaper, nevrotoksisitet og smittsomhet mellom de to isoformer. En slik studie vil gi betraktelig bedre vår forståelse av de smittsomme proteinholdige patogener. Fysiologi og patofysiologi av iPrP C er uklart i dag. Spesielt, i en nylig-identified menneskelig prionsykdom kalles variabelt protease-sensitive prionopathy, fant vi en ny PrP Sc som deler immunoreaktiv atferd og fragmentering med iPrP 11 C, 12. Videre har vi nylig vist at iPrP C er den viktigste arten som samhandler med amyloid-β protein i Alzheimers sykdom 13. I den samme studien, ble disse metodene brukes til å isolere Ap aggregater og oligomerer i Alzheimers sykdom 13, noe som tyder sin søknad til ikke-prionproteinet tilslag involvert i andre nevrodegenerative lidelser.
Protocol
Discussion
Kombinasjonen av tilnærminger som rapporteres her isolerer konsekvent uløselige PrP C aggregater og løselig PrP C oligomerer fra normal menneskelig hjerne. Ultrasentrifugering ved 100.000 xg i en time er en klassisk metode som har vært mye brukt for separering av det uløselige PrP Sc fra løselig PrP C 14. Mens den er effektiv, en av de forsiktighetsregler er å unngå forurensning under trekking supernatanten (S2) etter sentrifugering. Siden gel profilen iPrP C</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den Forfatterne er takknemlige for den menneskelige hjerne og spinalvæske Resource Center (Los Angeles, CA) for å gi normal hjerne prøver. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, den CJD Foundation, Alliance BioSecure, samt University Center on Aging og helse med støtte fra McGregor Foundation og presidentens Konjunkturfølsomme Fund (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
