En ny art av cellulärt prionprotein (PrP<sup> C</sup>) Har nyligen identifierats i oinfekterade humana hjärnor med användning av de metoder som beskrivs här. Dessa metoder kan användas för att isolera olika PrP arter, medan vissa av dem är också användbara för att isolera andra felveckade proteinaggregat från mänskliga hjärnor.
Den centrala händelsen i patogenesen av prionsjukdomar omfattar en omvandling av värd-kodade cellulärt prionprotein PrP ^ till dess patogena isoform PrP ^ 1. PrP C är tvättmedel-löslig och känsliga för proteinas K (PK)-nedbrytning, medan PrP bildar tvättmedel olösliga aggregat och är delvis resistent mot PK 2-6. Omvandlingen av PrP ^ till PrP ^ är känt för att involvera en konformationsförändring övergång av α-helix till β-arkstrukturer av proteinet. Emellertid är in vivo-reaktionsvägen fortfarande dåligt förstådd. Ett preliminärt endogen PrP, mellanliggande PrP * eller "tyst prion", har ännu inte identifieras i infekterade hjärnan 7.
Med en kombination av biofysiska och biokemiska metoder, identifierade vi olösliga PrP C aggregat (betecknade iPrP C) från infekterade däggdjur hjärnor och odlade neuronalaceller 8, 9. Här beskriver vi detaljerade förfaranden av dessa metoder, inkluderande ultracentrifugering i detergentbuffert, sukros-steggradient sedimentering, storleksuteslutande kromatografi, iPrP anrikning av gen 5-proteinet (G5p) som specifikt binder till strukturellt förändrade PrP former 10 och PK-behandling. Kombinationen av dessa metoder isolerar inte bara olöslig PrP och PrP C aggregat, men också lösliga PrP C oligomerer från det normala mänskliga hjärnan. Eftersom protokollen beskrivs här har använts för att isolera både PrP från infekterade hjärnor och iPrP C från oinfekterade hjärnor, ger de oss en möjlighet att jämföra skillnader i fysikalisk egenskaper, neurotoxicitet och smittsamhet mellan de två isoformer. En sådan studie kommer att avsevärt förbättra vår förståelse av de smittsamma proteinhaltiga patogener. Fysiologi och patofysiologi iPrP C är oklar i dagsläget. Särskilt i en nyligen identified människor prionsjukdom kallas variabelt proteaskänsliga prionopathy fann vi en ny PrP som delar immunreaktiva beteende och fragmentering med iPrP C 11, 12. Dessutom visade vi nyligen att iPrP C är den viktigaste arter som interagerar med amyloid-β protein i Alzheimers sjukdom 13. I samma studie var dessa metoder för att isolera Abeta aggregat och oligomerer vid Alzheimers sjukdom 13, vilket tyder på deras tillämpning på icke-prion proteinaggregat involverade i andra neurodegenerativa sjukdomar.
Kombinationen av metoder som redovisas här isolerar genomgående olösliga PrP C aggregat och lösliga PrP C oligomerer från det normala mänskliga hjärnan. Ultracentrifugering vid 100.000 xg under en timme är en klassisk metod som har använts i stor utsträckning för separation av den olösliga PrP från den lösliga PrP ^ 14. Även om det är effektivt, ett av varningar är att undvika kontamination under dra supernatanten (S2) efter centrifugering. Eftersom…
The authors have nothing to disclose.
Den Författarna är tacksamma för den mänskliga hjärnan och ryggmärgsvätskan Resource Center (Los Angeles, Kalifornien) för att tillhandahålla normala hjärnan prover. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01NS062787 har CJD Foundation, Alliance biologiskt säkra, liksom University Center on Aging och hälsa med stöd av McGregor Foundation och presidentens Discretionary fond (Case Western Reserve University) .
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |