一个荧光识别GIRK通道调制器的筛选试验
Summary
一个确定药物相互作用与G蛋白门控内向整流钾实时甄别<sup> -</sup>（GIRK）通道描述。该法采用膜电位敏感荧光染料来衡量GIRK通道活性。这项技术是适应的细胞株上使用。
Abstract
G蛋白门控内向整流钾 （GIRK）通道功能广泛的激素和神经递质的细胞介质，并在大脑，心脏，骨骼肌和内分泌组织1,2表示。 GIRK通道成为激活后的配体结合（神经递质，激素，药物等），其细胞膜结合，G蛋白偶联受体（GPCRs）。这种结合使G蛋白（G I GØ），随后结合并激活GIRK通道的刺激。一旦打开了GIRK通道允许的K运动导致细胞静息膜电位变得更负+。因此，GIRK通道激活的神经元减少自发性动作电位的形成和抑制兴奋性神经递质的释放。在心脏，激活GIRK通道的抑制起搏器的活性，从而减缓心率。
<p为开发新的治疗药物，治疗神经痛，吸毒，心律失常和其他疾病3类=“jove_content”的GIRK通道代表的新的目标。然而，这些通道的药理学仍然人迹罕至。虽然一些药物，包括抗心律失常药物，抗精神病药和抗抑郁药阻止GIRK通道，这种抑制是没有选择性的，发生在相对 较高的药物浓度3。在这里，我们描述了一个实时的筛选试验，确定新的调制GIRK通道。在这个实验中，神经AtT20细胞，表达GIRK通道，装有膜电位敏感荧光染料，如双（1,3 – dibutylbarbituric酸）的三甲oxonol [DiBAC 4（3）]或021-152 HLB值（ 图1 ）。染料分子成为强烈荧光以下的摄取进入细胞内（ 图1）。治疗GPCR的配体细胞刺激GIRK通道打开。由此产生的K +外流的细胞，导致膜电位变得更负，荧光信号降低（ 图1）。因此，GIRK通道通过调节钾离子流出的药物可以用荧光酶标仪测定。不同于其他离子通道筛选试验，如原子吸收光谱法4或放射性分析5，GIRK通道荧光检测提供了一种快速，实时和廉价的甄别程序。
Protocol
Discussion
虽然膜电位敏感荧光染料已被用来确定调节离子通道的药物，9,10，这是他们的神经GIRK通道药物发现中的应用的第一次报告。这里GIRK通道荧光检测提供了快速，可靠，实时的方法，筛选配体门控K +通道。与细胞的永生细胞株（HEK293细胞，CHO等）表达一个外生重组GIRK通道11或克隆细胞株（AtT20，PC-12）表达的内源性通道的广泛使用，可以修改该法。此外，该法可适应在胚胎干…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国公共卫生服务奖NS-071530。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
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