GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ
Summary
Gタンパク質依存性内向き整流Kと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニングの手順<sup> +</sup>（GIRK）チャンネルが記載されています。アッセイは、GIRKチャネル活性を測定する膜電位感受性蛍光色素を利用しています。この手法は、セルの行数での使用に適応可能である。
Abstract
Gタンパク質依存性内向き整流K +（GIRK）チャンネルはホルモンや神経伝達物質の広い範囲の細胞のメディエーターとして機能し、脳、心臓、骨格筋、内分泌組織の1,2で表されます。 GIRKチャネルは、それらの細胞膜結合型のリガンド（神経伝達物質、ホルモン、薬物など）、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の結合後に有効になります。この結合は、その後に結合し、GIRKチャネルを活性化するGタンパク質（G iとG o）の刺激を引き起こす。一度GIRKチャネルは、Kの動きを可能にする+外より負になるための静止膜電位を引き起こす細胞からオープンしました。その結果、ニューロンのGIRKチャネルの活性化は、自発的活動電位の形成を減少させ、興奮性神経伝達物質の放出を阻害する。心の中で、GIRKチャネルの活性化は、それによって心拍数を遅くするペースメーカー活性を阻害する。
<pクラス= "jove_content"> GIRKチャネルは、神経因性疼痛治療、薬物中毒、不整脈や他の疾患3の新しい治療薬の開発のための新たな目標を表すものです。しかし、これらのチャネルの薬理学は、主に未踏のままです。抗不整脈薬、抗精神病薬や抗うつ薬を含む薬物の数は、GIRKチャネルをブロックするが、この阻害は選択ではなく、相対的に高い薬物濃度を3で発生します。ここでは、GIRKチャネルの新たなモジュレーターを同定するためのリアルタイムスクリーニングアッセイを説明します。このアッセイでは、GIRKチャネルを発現神経AtT20細胞は、例えば、ビス- （1,3 – dibutylbarbituric酸）トリメチンオキソノール[DiBAC 4（3）]またはHLB 021から152（ 図1のような膜電位感受性蛍光色素を使用してロードされ。）色素分子は、細胞（ 図1）に強い蛍光を、次の取り込みになります。治療GPCRリガンドと細胞のGIRKチャネルを開くために刺激する。細胞外の結果K +流出は、膜電位がより負と減少する蛍光シグナル（ 図1）になるようになります。したがって、GIRKチャネルを介してK +流出を調節する薬剤は蛍光プレートリーダーを用いてアッセイすることができます。他のイオンチャネルスクリーニングアッセイなど、原子吸光分析法4または放射性トレーサー解析5と異なり、GIRKチャネル蛍光アッセイは、高速リアルタイムかつ安価なスクリーニング法を提供します。
Protocol
Discussion
膜電位感受性蛍光色素がイオンチャネルを調節する薬物9,10を識別するために使用されているが、これはニューロンのGIRKチャネル創薬への応用の最初の報告である。ここに提示GIRKチャネルの蛍光アッセイは、リガンド依存性K +チャネルのスクリーニングのための、高速で信頼性の高いリアルタイムメソッドを提供します。アッセイは、内因性のチャネルを発現している外因性…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国公衆衛生局賞NS-071530によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
References
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