Флуоресцентные Анализ Скрининг на выявление каналов модуляторы GIRK
Summary
В режиме реального времени процедура скрининга для выявления наркотиков, которые взаимодействуют с G белком закрытый внутренний выпрямитель K<sup> +</sup> (GIRK) каналов описана. Анализ использует мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители для измерения GIRK канал деятельности. Этот метод можно адаптировать для использования на нескольких клеточных линий.
Abstract
G белка закрытого внутреннего выпрямителя K + (GIRK) каналы работают, как сотовые посредников широкий спектр гормонов и нейромедиаторов и выражаются в головной мозг, сердце, скелетные мышцы и 1,2 эндокринной ткани. GIRK каналы активируются после связывания лигандов (нейромедиаторов, гормонов, лекарств и т.д.), их плазма мембраной, G-белком рецепторы (GPCR). Это связывание приводит к стимуляции G белка (G я и G о), которая впоследствии связывать и активировать канал GIRK. После открытия канала GIRK позволяет движение К + из клетки вызывает покоя мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным. Как следствие, GIRK канала активации нейронов уменьшается спонтанное формирование потенциала действия и ингибирует высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров. В сердце активации канала GIRK ингибирует активность водителя ритма, замедляя тем самым частоту сердечных сокращений.
<pкласс = "jove_content"> GIRK каналы представляют собой новых целей для разработки новых терапевтических агентов для лечения нейропатической боли, наркомания, нарушения ритма сердца и других заболеваний 3. Тем не менее, фармакологии этих каналов остается мало изученной. Несмотря на ряд лекарственных средств, включая антиаритмические препараты, антипсихотические средства и антидепрессанты блокируют канал GIRK, это торможение не является избирательным и происходит при относительно высокой концентрации препарата 3.Здесь мы описываем в режиме реального времени скрининге для выявления новых модуляторов каналов GIRK. В данном анализе нейронов AtT20 клетки, выражая GIRK каналы, которые загружаются с мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители, такие как бис-(1,3-dibutylbarbituric кислота) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] или HLB 021-152 (рис. 1 ). Молекул красителя стало сильно люминесцентные следующие поступления в клетки (рис. 1). Лечениеклеток с лигандами GPCR стимулирует GIRK каналы, чтобы открыть. В результате отток K + из клетки приводит к тому, мембранный потенциал, чтобы стать более отрицательным и флуоресцентного сигнала уменьшается (рис. 1). Таким образом, препараты, которые модулируют K + истечение через канал GIRK могут быть проанализированы помощью флуоресцентных планшетов. В отличие от других ионных каналов скрининга, например атомно-абсорбционной спектрометрии 4 или радиоактивный анализ 5 канал GIRK флуоресцентного анализа позволяет быстро, в режиме реального времени и недорогая процедура отбора.
Protocol
Discussion
В то время как мембранный потенциал-чувствительные флуоресцентные красители были использованы для идентификации препаратов, которые модулируют ионных каналов 9,10, это первый доклад их применения для нейронов GIRK канал лекарственных препаратов. GIRK канала флуоресцентного анализа…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана США Public Health Service награды NS-071 530.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
