性发展和有性放电禾谷镰刀菌</em

Summary

性杂交和重组后代的隔离是丝状真菌的重要研究工具，<em>禾谷镰刀菌</em>，必要的技术，成功地开展这些过程。

Abstract

禾谷镰刀菌已成为一个模型系统开发和丝状真菌的致病性研究。 楼菌最容易产生子实体，称为子囊壳，胡萝卜琼脂。子囊壳含有大量的组织类型，在子囊发展的特定阶段产生。这些措施包括（按出场顺序）形成子囊缩写（上升到ascogenous菌丝），外墙，侧丝（无菌菌丝占据子囊中心，直到ASCI发展），子囊和子囊在ASCI ^14。这些组织的发展，相隔约24小时，并一直在性发展^12,8转录研究的基础上。哈伦等人 （2007年）的发展更深入的说明，包括每个阶段的照片。在这里，我们提出的方法，产生和收获同步LY发展子囊草坪时空的基因调控，发展和生理过程的研究。虽然这些方法是专门用于与楼菌 ，该技术可以用于其他各种真菌，规定可以培养诱导出菇，并有一定的发展同步。最近，我们已经适应了这个协议研究楼性发展verticillioides。虽然个别子囊必须手工采摘，在这个物种，因为发展中国家子囊壳的草坪，不能诱导，工作过程以及研究发展（Sikhakolli和步道，未发表）。

真菌子实体的最重要的功能是分散孢子。子囊菌门（子囊生产真菌），许多物种，射门从子囊孢子，由于代膨压力范围内的子囊，驾驶弹射孢子（和epiplasmic流体）通过在子囊尖端^2,7孔。发展“孢子放电法”，这是我们使用的筛选过程中的突变导致我们强行子囊孢子放电的研究。在这里，我们提出这个实验的细节。

小麦赤霉病是homothallic，从而可以在兼容的合作伙伴的情况下形成的子实体。同宗配合的优势是隧道是没有必要的，以产生特定性状的后代，促进性发展的研究方面在这个物种^14,7合子。然而，异宗株已产生可用于穿越^5,9。它也可能跨越homothallic株，获得1株^1中的几个基因的突变。这是通过一个培养皿coinoculating 2株。沿交汇点，子囊多数将重组（父株突变不抑制杂交）。子囊壳的年龄，他们散发出子囊集体，而不是强行履行。所产生的孢子渗出物（称为一个cirrhus）位于子囊尖和恢复单个孢子可以很容易地删除。在这里，我们提出了一个协议，以方便识别重组子囊壳和重组后代恢复。

Protocol

1。产生子囊壳中心接种胡萝卜琼脂6.0厘米直径的Petri与楼肥沃的应变菜10 禾谷 （推荐的PH-1）。 接种在室温（18-24℃）明亮的荧光灯下的菜，让菌丝生长，直到已达到外缘的培养皿（3-5天）。商用家用的日光灯做工精细，刺激子实体的形成和排放。 轻轻取出用无菌牙签的气生菌丝。 分发1.0毫升2.5％吐温60水溶液的表面用无菌玻璃曲棍球棒或无菌玻璃棒圆润结束。 返回光板。不添加石蜡膜板。 24小时后，板表面应该有一个闪亮的外观。如果再次出现菌丝体，刮去表面和重新申请吐温60的解决方案。 在未来一周观察的子囊发展。中间阶段子囊发展可收获轻轻刮表面冻结提取RNA（ 图1）琼脂和闪光灯。 成熟的孢子会积聚在7天板盖。最初，这些只会在解剖显微镜下可见，但9天，他们将已经积累了足够的密度，以肉眼可见。 2。 。子囊放电分析第6天吐温的解决方案的应用程序后，切开一个1厘米直径的圆琼脂木钎。另外，手术刀可以用来删除一个类似大小的段。圆可以被切成一半，各占一半放在玻璃显微镜幻灯片。 东方件，所以包含子实体表面是垂直滑动面，孢子被解雇的幻灯片的长度。 放置在湿度室的灯光下过夜的幻灯片。孢子会积聚在幻灯片和第二天早上（ 图2）肉眼可见。 累计孢子可以洗掉的水滑梯，量化，如果需要的话。 潜在的子囊孢子放电抑制剂可以将它们添加到琼脂块在背面装配检测检测。一些离子通道抑制剂，减少排放先前已检测用这种方法15。 3。代重组后代发起与两楼株接种胡萝卜琼脂跨越禾谷镰刀菌 （尼特+一NIT），放置在培养皿两侧的接种点。 一旦菌丝填补表面，刮去空中部分和申请吐温-60解决方案，如上所述。使用标记要注意培养皿菌丝的一面。 返回光的文化和孵化，直到子囊已经制定，并cirrhi有从子囊壳沿两种文化之间的交汇，形成枪。 解剖显微镜下，将进入查看子囊沿两种文化的交叉点。利用昆虫针，将消毒和无菌水浸泡，沿着这条边界接触1 cirrhus轻轻用针的尖端。应该让cirrhus坚持引脚引脚上的水分。 冲洗它cirrhus在Eppendorf管洗孢子在200μL无菌水针的尖端。 火焰脚，滋润了一遍，并选择另一个cirrhus。挑选10至15 cirrhi，并放置在每一个单独的水管。 简要涡管含有悬浮cirrhi。 取出60μL的孢子悬浮在9厘米的培养皿用吸管和地方MMTS介质1。用无菌曲棍球棒的传播。余下的孢子悬浮液在4°C，可存储长达一个星期，如有必要replated。 incuba在室温为3-5天（光没有必要）TE，直到出现非常小的菌落（ 图3）。会有两种殖民地之间的表型。 NIT的殖民地，将有稀疏菌丝比尼特+克隆。从重组子囊cirrhi将显示比例大致相等的两个殖民地的表型。丢弃板，只对他们的单一型的殖民地。请注意，有时两个以上的表型隔离等因素导致因。 V8或胡萝卜琼脂存储移动殖民地。确认正确的表型;察氏的阿霉素琼脂（NIT-株不会增长察氏的阿霉素），PDA与氯酸钾（NIT +菌株不会长0.5米PDA与氯酸钾氯酸钾）测试的殖民地。检查所需的素质这些殖民地。 4。代表结果产生子囊壳我们的目标是有草坪子囊壳没有任何菌丝或孢子明显。文化的表面会出现类似的黑色天鹅绒（ 图1）。吐温的应用在24小时后，在琼脂表面有轻微的光泽。如果菌丝再现，然后板可能不会被擦到足以产生子囊发展。 子囊孢子放电始终提供您的检测琼脂的几个街区，从野生型菌株。如果这些不火，那么无论你的子囊壳是太年轻或太老。如果他们是太旧了，然后会出现大量菌丝在表面的文化给它一个白色的色调。如果不是这样的情况下，他们可能是太年轻了，该法应再次尝试在24小时。偶尔，文化不履行良好，将不得不重复实验。务必执行适当的光照条件下检测。 重组后代<p class="jove_content">重组子囊应子囊壳大部分沿两个菌株之间的交叉点。我们通常从跨处理10 cirrhi和那些至少4-6应该重组。很偶然，突变防止从交配应变。如果父母一方有异常的增长型，那么超过2表型可能是目前MMTS的殖民地之间。 图1。胡萝卜琼脂子囊发展阶段。左，72小时后吐温的应用。注意红色颜料和黑色颗粒表面上可见的非常年轻的子囊壳。右，在144 h，已形成成熟的子囊壳。注意接近完成的情况下，在两种文化的肤浅菌丝。 图2。放电检测。橙色的胡萝卜琼脂插件是面向所以THA载玻片表面，ţ强行出院，从成熟的子囊壳在其表面的孢子可以积累。积累时间为15小时。 图3。增长尼特+和介质选择性MMTS NIT-殖民地之间的差异。 NIT的殖民地（箭头）较小。 NIT的殖民地（箭头），显示出强劲的增长。拍照后7天。

Discussion

小麦赤霉病是特别适合子实体发展的研究，由于良好注释的基因组（可用性mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ^{4），Affymetrix}公司的可用性基于芯片^6。这有助于识别能力，为子囊孢子放电^7,11,3重 ​​要的基因。这里介绍的方法将允许研究人员关注的发展阶段和功能的一组离散楼子实体的遗传分析禾谷 。方法也很容易适应相关的真菌可以诱导水果文化，可以作为一个发展中的各种其他真菌子实体类型的标准。

能力评估孢子发射型孢子小，很难看到的物种，如可以是微妙<eM> F。禾谷。一个干净的幻灯片孢子的收集有利于双方的视觉评估和定量评估，为孢子可以洗掉的幻灯片和定量分析。一些真菌物种产生一种粘液，围绕着他们的孢子，孢子不能被冲​​洗掉，但必须计算显微镜，他们留在幻灯片上。我们已经发现这个菌核病是真实的。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Fusarium graminearum strain PH-1	Fungal Genetics Stock Center, Kansas	FGSC 9075
Tween 60	Sigma-Aldrich	P1629
Czapek’s Dox Agar	Difco, Becton Dickinson	233810
Potassium Chlorate	Sigma-Aldrich	255572