Сексуальное развитие и аскоспор разряда в Fusarium graminearum</em

Summary

Сексуальные кресты и изоляции рекомбинантного потомства являются важным инструментом исследования для нитчатых грибов,<em> Fusarium graminearum</em> Методам необходимо успешно осуществлять эти процессы представлены.

Abstract

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci¹⁴. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development^12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).

The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip^2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a “spore discharge assay”, which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.

F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species^14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing^5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain¹. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Protocol

1. Производство Перитеции Центр прививки морковь агар 10 в 6,0 см диаметр чашки Петри с плодородной штамма F. graminearum (рекомендуется PH-1). Место привиты блюда под яркой лампы дневного света при комнатной температуре (18-24 ° С) и позволяют расти, пока мицелий достигает внешнего края чашки Петри (3-5 дней). Коммерческая бытовых люминесцентных ламп прекрасно работать для стимулирования плодоношения формирования тела и разряда. Аккуратно снимите воздушный мицелий стерильным зубочисткой. Распространение 1,0 мл 2,5% Tween 60 AQ на поверхность стерильным hockeystick стекла или закругленный конец стерильной стеклянной палочкой. Вернуться пластин на свет. Не добавляйте к парафильмом пластин. После 24 часов, на поверхности пластин должна иметь блестящий внешний вид. Если мицелий появляется, поверхностные царапины и повторно применить твин-60 решение. Соблюдайте развития перитеции в течение следующей недели. Промежуточных стадияхperithecium развития могут быть собраны, мягко очищая поверхность агара и флэш заморожены для выделения РНК (рис. 1). Зрелые споры будут накапливаться на крышке пластинки в день 7. Первоначально это будут видны только под микроскопом рассечения, но 9-й день, они накопили достаточной плотности, чтобы быть видимыми невооруженным глазом. 2. Аскоспор разряда Пробирной На 6-й день после нанесения раствора Tween, нарезать 1 см диаметр круга из агара с дерева сверло. Кроме того, скальпель может быть использован для удаления такого же размера сегмента. Круг может быть нарезанный пополам и каждую половину помещают на предметное стекло микроскопа стекло. Восток куски так, поверхность, содержащую плодовые тела перпендикулярно к поверхности слайда, а также споры уволен по всей длине затвора. Поместите слайд в камере влажности в течение ночи в свет. Споры будут накапливаться наскольжения и быть видимыми невооруженным глазом на следующее утро (рис. 2). Накопленный споры могут быть смыты водой слайдов и количественно, если это необходимо. Потенциальные аскоспор ингибиторов разряда могут быть проанализированы, добавив их в обратную сторону агара при сборке блока анализа. Некоторые ингибиторы ионных каналов, которые снижают разряд ранее анализировали с помощью этой техники 15. 3. Генерация рекомбинантного потомства Начать пересекать путем посева моркови агар с двумя штаммами F. graminearum (один Nit + и один-нит), поставив прививку точек на противоположных сторонах чашки Петри. После гифы заполнили поверхность, соскрести воздушной части и применить твин-60 решение, как описано выше. Используйте маркер, чтобы отметить на стороне чашки Петри, где гифы с концами. Вернуться культуры к свету и инкубировать до перитеции разработали и cirrhi были бытьпистолет для формирования из перитеции по линии пересечения двух культур. При вскрытии микроскоп, привести в просмотр перитеции по линии пересечения двух культур. Использование насекомых контактный, стерилизуют и опускают в стерильную воду, трогать cirrhus вдоль этой границы легко кончиком пальца. Влажность на выводе должно позволить cirrhus придерживаться выводов. Промойте кончик штифта с cirrhus на нем в 200 мкл стерильной воды в пробирку Эппендорфа мыть спор с. Пламя вывод, смочите его снова и выбрать другой cirrhus. Выберите от 10 до 15 cirrhi, и поместить каждый в отдельную пробирку с водой. Кратко вихревых труб, содержащих взвешенные cirrhi. Удалить 60 мкл суспензии спор с помощью пипетки и место на ММТС среды 1 в 9 см блюдо Петри. Распространение стерильным хоккейной клюшкой. Остальные подвески спор может храниться при температуре 4 ° С до недели и replated если это необходимо. Инкубациите при комнатной температуре (свет не обязательно) в течение 3-5 дней, пока очень небольшие колонии (Рисунок 3). Там будет два вида фенотипов среди колоний. Нит-колоний будет редким, чем гиф колоний Nit +. Cirrhi из рекомбинантных перитеции покажет как колония фенотипов примерно в равных пропорциях. Откажитесь от пластин с колониями только одного фенотипа на них. Обратите внимание, что иногда более чем в два фенотипа привести в связи с разделение других факторов. Перемещение колонии V8 или морковный агар для хранения. Испытание колонии на Dox агар Чапека (нит-штаммы не будут расти на Dox Чапека) и на КПК с хлорат (0,5 М хлорат калия, Nit штаммов + не будет расти на КПК с хлорат), чтобы подтвердить правильность фенотипа. Изучите эти колонии для желаемого качества. 4. Представитель Результаты Производство перитеции Цель состоит в том, чтобы газонперитеции без мицелия или спор очевидной. Поверхность культуры будет похож на черный бархат (рис. 1). В 24 часов после применения Tween поверхности агара должны быть легким блеском. Если мицелии появляются, то плита не может быть Царапины достаточно, чтобы вызвать perithecium развития. Аскоспор разряда Всегда предоставлять в анализе нескольких блоков агар от штамма дикого типа. Если те, не срабатывают, то либо ваш перитеции слишком молод или слишком стар. Если они слишком старые, то многочисленные гифы появится на поверхности культуры придав ему беловатый оттенок. Если это не так, они могут быть слишком молоды, и анализа должны быть вновь в 24 час. Иногда, культуры не выполнять хорошо, и эксперимент придется повторить. Убедитесь, что вы выполните тест при определенных условиях освещения. Рекомбинантный потомство <p class="jove_content"> Рекомбинантного перитеции должны составлять большинство перитеции по линии пересечения двух штаммов. Мы обычно перерабатывать до 10 cirrhi с креста и по крайней мере 4-6 из тех, должны быть рекомбинантные. Очень редко, мутация препятствует деформации от спаривания. Если один из родителей имеет фенотип аберрантных роста, то более чем в 2 фенотипы могут присутствовать среди колоний на ММЦ. Рисунок 1. Этапы развития perithecium на морковь агара. Левые, 72 ч после применения Tween. Обратите внимание, красный пигмент, и очень молодые перитеции видны как черные зерна на поверхности. Да, на 144 ч, зрелые перитеции сформировались. Обратите внимание, почти полное отсутствие поверхностного мицелия в обеих культурах. Рисунок 2. Разряда анализа. Оранжевый разъем агар морковь ориентирован так, тхат спор принудительно выписали из зрелых перитеции на ее поверхности может накапливаться на поверхности стекло. 15 часов времени накопления. Рисунок 3. Различия в росте между Nit + и нит-колоний на селективной среде ММЦ. Нит-колоний (наконечники стрел) меньше. Нить + колоний (стрелки) показывает устойчивый рост. Фотография сделана через 7 дней.

Discussion

Ф. graminearum особенно хорошо приспособлены к изучению плодоношения развитие тела в связи с наличием хорошо аннотированного генома ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ^4), а также наличие Affymetrix- основанный микрочипов ^6. Это способствовало возможность идентифицировать гены, важные для аскоспор разряда ^7,11,3. Методы, представленные здесь, позволяют исследователю сосредоточиться на дискретный набор этапов развития и функций для генетического анализа плодовых тел F. graminearum. Эти методы также легко адаптируется к связанным грибов, которые могут быть вызваны на фрукты в культуре, и может быть использован в качестве стандарта для развития целого ряда других грибковых типов тела плодоношения.

Способность оценивать фенотип стрельбы спор может быть тонким в вид, где споры малого и трудно понять, например, <eм> F. graminearum. Коллекция спор на чистую слайд облегчает и визуальной оценки и количественная оценка, так как споры могут быть смыты слайдов и количественно. Некоторые виды грибов производят слизь, которая окружает их споры и споры не могут быть смывается, но должны учитываться микроскопически они остаются на слайде. Мы нашли, что это верно Sclerotinia sclerotiorum.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Fusarium graminearum strain PH-1	Fungal Genetics Stock Center, Kansas	FGSC 9075
Tween 60	Sigma-Aldrich	P1629
Czapek’s Dox Agar	Difco, Becton Dickinson	233810
Potassium Chlorate	Sigma-Aldrich	255572