Cruzamentos sexuais e isolamento da progênie recombinante são importantes ferramentas de pesquisa para o fungo filamentoso,<em> Fusarium graminearum</em>, As técnicas necessárias com sucesso realizar estes processos são apresentados.
Fusarium graminearum tornou-se um sistema modelo para estudos em desenvolvimento e patogenicidade de fungos filamentosos. F. graminearum mais facilmente produz corpos de frutificação, chamados peritécios, em ágar cenoura. Peritécios conter inúmeros tipos de tecidos, produzidas em fases específicas do desenvolvimento peritécio. Estes incluem (por ordem de aparecimento) a formação de as iniciais peritécio (que dão origem às hifas ascogenous), a parede exterior, paráfise (micélios estéril que ocupam o centro do peritécio até que o ascos desenvolver), o ascos, e os ascósporos dentro do ascos 14. O desenvolvimento de cada um destes tecidos é separado por aproximadamente 24 horas e tem sido a base em estudos transcriptomic durante o desenvolvimento sexual 12,8. Consulte Hallen et al. (2007) para uma descrição mais completa do desenvolvimento, incluindo fotografias de cada etapa. Aqui, apresentamos os métodos para gerar e colher síncronaly desenvolvimento de gramados de peritécios para estudos temporais de regulação gênica, desenvolvimento e processos fisiológicos. Embora estes métodos são escritos especificamente para ser utilizado com F. graminearum, as técnicas podem ser utilizadas para uma variedade de outros fungos, desde que a frutificação pode ser induzida em cultura e há algum sincronia com o desenvolvimento. Recentemente adaptado este protocolo para estudar o desenvolvimento sexual de F. verticillioides. Embora peritécios indivíduo deve ser colhido manualmente nesta espécie, porque um gramado de desenvolver peritécios não poderia ser induzido, o processo funcionou bem para estudar o desenvolvimento (Sikhakolli e Trail, inédito).
A função mais importante de corpos de frutificação de fungos é a dispersão de esporos. Em muitas das espécies de Ascomycota (ascus produzindo fungos), os esporos são disparadas a partir do ascus, devido à geração de pressão de turgescência dentro do ascus, dirigindo ejecção de esporos (e fluido epiplasmic) através doporo na ponta ascus 2,7. Nossos estudos de descarga de ascósporos forçada resultaram no desenvolvimento de um "ensaio de descarga de esporos", que usamos para triagem de mutações no processo. Apresentamos aqui os detalhes deste ensaio.
F. graminearum é homothallic e, portanto, pode formar corpos de frutificação, na ausência de um parceiro compatível. A vantagem de homothallism é que atravessamento não é necessária para gerar descendência homozigótica para um traço particular, uma faceta que facilitou o estudo do desenvolvimento sexual nesta espécie 14,7. No entanto, as estirpes heterotálico ter sido gerados que podem ser utilizados para a passagem 5,9. É também possível para atravessar as estirpes homothallic para se obter mutantes para vários genes na estirpe um 1. Isso é feito por coinoculating uma placa de Petri com 2 estirpes. Ao longo do ponto de encontro, a maioria dos peritécios será recombinante (fornecida uma mutação em uma das estirpes-mãe não inibede cruzamento). Com a idade peritécios, eles exalam ascósporos em massa ao invés de descarregá-los à força. O exsudado de esporos resultante (chamado um cirrhus) senta-se a ponta do peritécio e pode ser facilmente removido para a recuperação de esporos individuais. Aqui nós apresentamos um protocolo para facilitar a identificação de recombinante peritécios ea recuperação da progênie recombinante.
F. graminearum está particularmente bem adaptado para o estudo do desenvolvimento corpo de frutificação, devido à disponibilidade de um genoma bem anotado ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ; 4), e da disponibilidade de uma Affymetrix- baseado microarray 6. Isto facilitou a capacidade de identificar genes importantes para ascósporos descarga 7,11,3. Os métodos apresentados aqui permitirá que o pesquisador se concentrar em um conjunto discreto de estágios de desenvolvimento e funções para a análise genética dos corpos de frutificação de F. graminearum. Os métodos também são facilmente adaptáveis a fungos relacionados que podem ser induzidos a fruta em cultura, e pode ser usado como um padrão para o desenvolvimento de uma variedade de outros tipos de corpo de frutificação fúngicas.
A capacidade de avaliar um fenótipo de disparo de esporos podem ser sutis em espécies onde os esporos são pequenos e difíceis de ver, como <em> F. graminearum. A coleção de esporos em uma lâmina limpa facilita a avaliação visual, e avaliação quantitativa, como esporos podem ser lavados fora do slide e quantificada. Algumas espécies de fungos produzir uma mucilagem que rodeia o seu esporo e os esporos não pode ser retirado com água, mas deve ser contados microscopicamente como eles permanecem sobre a lâmina. Nós descobrimos que isso é verdade de Sclerotinia sclerotiorum.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Science Foundation (MCB-0923794 para FT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center, Kansas | FGSC 9075 |
Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 |
Czapek’s Dox Agar | Difco, Becton Dickinson | 233810 |
Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |