Seksuel udvikling og Ascospore decharge Fusarium graminearum</em

Summary

Seksuelle kors og isolering af rekombinant afkom er vigtige forsknings-værktøjer til trådsvamp,<em> Fusarium graminearum</em> Teknikkerne nødvendige at føre disse processer er præsenteret.

Abstract

Fusarium graminearum er blevet et modelsystem til undersøgelser i udvikling og patogenicitet af filamentøse fungi. F. graminearum lettest producerer frugtlegemer, kaldet perithecia på gulerod agar. Perithecia indeholder mange vævstyper, der er produceret på bestemte stadier af perithecium udvikling. Disse omfatter (i rækkefølgen) dannelse af perithecium bogstaverne (som giver anledning til ascogenous hyfer) og den ydre væg, paraphyses (sterilt mycelier som optager midten af ​​perithecium indtil AscI udvikle), den Ascl, og ascosporer i Ascl ^14. Udviklingen af hver af disse væv er adskilt af cirka 24 timer og har været grundlag af transkriptom studier i løbet af seksuel udvikling ^12,8. Se Hallen et al. (2007) for en mere grundig beskrivelse af udviklingen, herunder fotografier af hver etape. Her vil vi præsentere de metoder for generering og høst synkronly udvikle græsplæner i perithecia for tidsmæssige studier af genregulering, udvikling og fysiologiske processer. Selv om disse fremgangsmåder er skrevet specielt til anvendelse sammen med F. graminearum, kan teknikker anvendes til en række andre svampe, forudsat at frugtsætning kan induceres i kultur, og der er en vis synkroni til udvikling. Vi har for nylig tilpasset denne protokol for at studere den seksuelle udvikling af F. verticillioides. Selvom enkelte perithecia skal håndplukket i denne art, fordi en græsplæne for at udvikle perithecia ikke kunne fremkaldes, processen fungeret godt for at studere udvikling (Sikhakolli og Trail, upubliceret).

Den vigtigste funktion svampe frugtlegemer er spredning af sporer. I mange af de arter af Ascomycota (ASCUS fremstilling svampe), der sporer skudt fra ASCUS på grund af dannelsen af ​​saftspændingen i ASCUS, drivende udstødning af sporer (og epiplasmic væske) gennempore i ASCUS spids ^2,7. Vore undersøgelser af tvungen ascospore udledning har resulteret i udviklingen af ​​en "spore udledning analyse", som vi bruger til at screene for mutationer i processen. Her præsenterer vi detaljerne i denne analyse.

F. graminearum er homothallic, og dermed kan danne frugtlegemer i mangel af en kompatibel partner. Den fordel homothallism at passagen ikke er nødvendigt at generere afkom homozygot for en bestemt egenskab, en facet der har lettet studiet af seksuel udvikling i denne art ^14,7. Imidlertid har heterothallic stammer blevet dannet, som kan anvendes til at passere ^5,9. Det er også muligt at passere homothallic stammer til opnåelse af mutanter i flere gener i en stamme ^1. Dette gøres ved coinoculating en petriskål med 2 stammer. Langs mødepunkt, vil hovedparten af ​​perithecia være rekombinant (tilvejebragt en mutation i et af de forælder-stammer inhiberer ikkeudkrydsning). Som perithecia alder, udstråler de ascosporer massevis i stedet for med magt at aflade dem. Den resulterende sporer ekssudat (kaldet en cirrhus) sidder på spidsen af ​​perithecium og kan nemt fjernes for inddrivelse af de enkelte sporer. Her præsenterer vi en protokol for at lette identifikationen af ​​rekombinant perithecia og inddrivelse af rekombinante afkom.

Protocol

1. Produktion Perithecia Centret podes gulerod agar 10 i et 6,0 cm diameter petriskål med en frugtbar stamme af F. graminearum (Tip PH-1). Sted inokuleret retter under klart fluorescerende lys ved stuetemperatur (18-24 ° C) og tillade at vokse, indtil myceliet har nået den ydre kant af petriskålen (3-5 dage). Kommercielle husholdnings lysstofrør fungerer fint for at stimulere frugtlegemet dannelse og udledning. Fjern forsigtigt luftmycelier med en steril tandstikker. Distribuere 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq til overfladen med en steril glas hockeystick eller afrundede ende af en steril glasstav. Tilbage plader for lys. Tilsæt ikke Parafilm til plader. Efter 24 timer, skal overfladen af ​​pladerne har et skinnende udseende. Hvis mycelia igen, skrabe overfladen og søge igen Tween-60-løsning. Vær opmærksom på udvikling af perithecia løbet af de næste uger. De mellemliggende stadier afperithecium udvikling kan høstes ved forsigtigt at skrabe overfladen af agaren og lynfrosset til RNA-ekstraktion (figur 1). Modne sporer vil akkumulere på låget af pladen på dag 7. Oprindelig blev disse vil kun være synlige under et dissektionsmikroskop, men på dag 9, vil de have akkumuleret tilstrækkelig tæthed, så de er synlige for det blotte øje. 2. Ascospore udledning Assay På dag 6 efter anvendelse af Tween-løsning, skære en 1 cm diameter cirkel ud af agar med et træ borer. Alternativt kan en skalpel anvendes til at fjerne en tilsvarende størrelse segment. Cirklen kan skåret i halve, og hver halvdel placeres på et objektglas. Orientere stykker, så overfladen indeholder frugtlegemer er vinkelret på overfladen af ​​objektglasset, og sporer brændes ned længden af ​​objektglasset. Placer dias i et fugtigt kammer natten under lys. Sporer vil samle sig påslæden og være synlig for det blotte øje næste morgen (figur 2). Akkumulerede sporer kan vaskes objektglasset med vand og kvantificeret hvis det ønskes. Potentielle ascospore udledning inhibitorer kan bestemmes ved at tilsætte dem til bagsiden af ​​agar blokken under samling af assayet. Nogle ionkanal-inhibitorer, som reducerer udledning tidligere er blevet analyseret med denne teknik 15. 3. Fremstillingen af ​​rekombinant afkom Start krydse ved at der indpodes gulerod agar med to stammer af F. graminearum (en Nit + og en nit-), at placere inokulering punkter på modstående sider af petriskålen. Når hyfer er fyldt overfladen skrabe antenne del og anvender Tween-60 opløsning som beskrevet ovenfor. Anvende en markør til at notere på den side af petriskålen, hvor hyfer mødes. Retur kulturer til lys og inkuber indtil perithecia har udviklet, og cirrhi har værepistol til dannelse af perithecia langs skæringen mellem de to kulturer. Under dissektionsmikroskop, sætter vist perithecia langs skæringen af ​​de to kulturer. Brug af et insekt ben, steriliseret og dyppet i sterilt vand, røre ved en cirrhus langs denne grænse let med spidsen af ​​pinden. Fugten på stiften skulle give de cirrhus at holde sig til stiften. Skylles spidsen af ​​stiften med cirrhus på det i 200 ul sterilt vand i en Eppendorf-rør for at vaske sporerne fra. Flame stiften, fugtes det igen og vælg et andet cirrhus. Pick 10-15 cirrhi og placere hver i et separat rør med vand. Kort fortalt vortexrør indeholder opslæmmede cirrhi. Fjernelse 60 ul af sporesuspensionen med en pipette og anbringes på MMTS medium 1 i en 9 cm petriskål. Fordel med en steril hockeystav. Den resterende sporesuspension kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge og genudpladet om nødvendigt. Incubate ved stuetemperatur (lys ikke nødvendigt) i 3-5 dage, indtil meget små kolonier vises (Figur 3). Der vil være to slags fænotyper blandt kolonierne. De NIT-kolonier har sparser hyfer end NIT +-kolonier. Cirrhi fra rekombinant perithecia vil vise både koloni fænotyper i omtrent lige forhold. Skille pladerne med kolonier af kun en enkelt fænotype på dem. Bemærk, at undertiden mere end to fænotyper resultatet som følge af adskillelse af andre faktorer. Bevæge kolonier til V8 eller gulerod-agar til opbevaring. Test kolonier på Czapek Dox s agar (de NIT-stammer vil ikke vokse på Czapek Dox s) og på PDA med chlorat (0,5 M kaliumchlorat, de NIT + stammer vil ikke vokse på PDA med chlorat) for at bekræfte korrekte fænotype. Behandle disse kolonier for de ønskede egenskaber. 4. Repræsentative resultater Produktion perithecia Målet er at have en plæne afperithecia uden mycelier eller sporer synlige. Overfladen af kultur vil ligne sort fløjl (Figur 1). Ved 24 timer efter påføring af Tween overfladen af ​​agar, bør have en lille overflade. Hvis mycelier igen, pladen derefter måske ikke blevet skrabet nok til at inducere perithecium udvikling. Ascospore udledning Altid i assayet flere blokke af agar fra vild-type stammen. Hvis de ikke ild, så enten dine perithecia er for ung eller for gammel. Hvis de er for gamle, og derefter adskillige hyfer vises på overfladen af ​​kulturen giver det en hvidlig farve. Hvis dette ikke er tilfældet, kan de være for lille, og assayet skulle prøves igen 24 timer. Lejlighedsvis, ikke kulturer ikke udledes godt, og forsøget skal gentages. Vær sikker på at du udføre analysen under de rette lysforhold. Rekombinant afkom <p class="jove_content"> Rekombinant perithecia skal udgøre størstedelen af ​​perithecia langs skæringen mellem de to stammer. Vi plejer at behandle 10 cirrhi fra et kors og mindst 4-6 af dem skal være rekombinant. Meget lejlighedsvis, en mutation forhindrer en stamme fra parring. Hvis en af ​​forældrene har en afvigende vækstfænotype, så er mere end 2 fænotyper kan være til stede blandt de kolonier MMTS. Figur 1. Stadier af perithecium udvikling på gulerod agar. Venstre 72 h efter påføring af Tween. Bemærk rødt pigment og meget ung perithecia synlig som en sort kerner på overfladen. Ret ved 144 h er modne perithecia dannet. Bemærk næsten fuldstændigt fravær af overfladisk mycelier i begge kulturer. Figur 2. Afladning assay. Den orange gulerod agarprop er orienteret så that sporer tvangsmæssigt udledt fra det modne perithecia på sin overflade, kan akkumuleres på overfladen af ​​objektglasset. 15 timer akkumulering tid. Figur 3. Forskelle i vækst mellem Nit + og NIT-kolonier om selektiv MMTS medium. De NIT-kolonier (pilespidser) er mindre. De NIT +-kolonier (pile) viser robust vækst. Fotografi taget efter 7 dage.

Discussion

F. graminearum er særligt godt tilpasset til studiet af frugtlegemet udvikling på grund af tilgængeligheden af en godt kommenteret genom ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , ^4), og tilgængeligheden af en Affymetrix- baseret mikroarray ^6. Det har fremmet evnen til at identificere gener, der er vigtige for ascospore udledning ^7,11,3. De metoder, der præsenteres her, vil gøre det muligt for forskeren at fokusere på en diskret sæt af udviklingsstadier og funktioner for genetisk analyse af frugtlegemer af F. graminearum. Fremgangsmåderne er også let at tilpasse til beslægtede svampe, som kan induceres til frugt i kultur, og kan anvendes som en standard til udviklingen i en række andre svampe frugtlegemet typer.

Evnen til at vurdere en spore fyring fænotype kan være subtile i arter, hvor sporer er små og svære at se, såsom <em> F. graminearum. Indsamling af sporer på et rent objektglas letter både visuel vurdering, og kvantitativ vurdering, som sporer kan vaskes objektglasset og kvantificeret. Nogle svampearter producere en slim, der omgiver deres spore, og sporerne ikke kan skylles væk, men skal tælles mikroskopisk, da de forbliver på diaset. Vi har fundet at dette er sandt af Sclerotinia sclerotiorum.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Fusarium graminearum strain PH-1	Fungal Genetics Stock Center, Kansas	FGSC 9075
Tween 60	Sigma-Aldrich	P1629
Czapek’s Dox Agar	Difco, Becton Dickinson	233810
Potassium Chlorate	Sigma-Aldrich	255572