Summary
Deze video protocol toont de toepassing van de fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voor de identificatie en scheiding van verschillende sub-populaties van cellen in humane glioblastoma gebaseerd op de frequentie van de celdeling.
Abstract
Tumor heterogeniteit is een fundamenteel kenmerk ondersteunende tumor robuustheid en presenteert een centrale belemmering voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën 1. Te overwinnen het probleem van tumor heterogeniteit is het noodzakelijk dat assays en instrumenten waarmee fenotypische, (epi) genetische en functionele identificatie en karakterisatie van tumor subpopulaties die specifieke ziekte pathologieën rijden en klinisch relevante doelen. Het is nu bekend dat tumoren vertonen verschillende deelfracties van cellen met verschillende frequenties van celdeling, en de functionele criterium dat langzaam fietsen positief geassocieerd met tumorvorming vermogen in verschillende kankers waaronder die van de hersenen, borst, huid en pancreas en leukemie 2-8. De fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) is gebruikt voor het volgen van de verdeling frequentie van cellen in vitro en in vivo in bloed overgedragen tumors en vaste tumoren zoals 2,7,8 glioblastoma. De cel-permeant niet fluorescerend pro-drug van CFSE omgezet door intracellulaire esterasen in een fluorescente verbinding, die binnen cellen vastgehouden door covalente binding aan eiwitten door reactie van de succinimidyl groep met intracellulaire aminegroepen vormen stabiele amidebindingen 9. De fluorescerende kleurstof wordt gelijkelijk verdeeld tussen dochtercellen op divisies leidt tot de halvering van de fluorescentie-intensiteit bij elke celdeling. Dit maakt het volgen van celcyclus frequentie tot acht tot tien ronden van sector 10. CFSE retentie capaciteit werd gebruikt met hersentumor cellen te identificeren en te isoleren van een langzaam fietsen subpopulatie (top 5% kleurstof-behoud van cellen) aangetoond worden verrijkt in kankerstamcel activiteit 2.
Dit protocol beschrijft de techniek van gekleurde cellen met CFSE en isolatie van afzonderlijke populaties in een cultuur van menselijke glioblastoom (GBM)-afgeleide cellen bezitten verschillende divisie tarieven met behulp van flowcytometrie 2. De techniek heeft gediend te identificeren en een hersentumor langzaam cycling populatie van cellen te isoleren door hun vermogen om de CFSE labeling behouden.
Protocol
1. Voorbereiden Glioblastoma enkele celsuspensie
- Gliomasphere cultuur wordt opgesteld en bijgehouden met behulp van de neurosfeer assay (NSA) zoals eerder beschreven 2,11,12.
- Zijner tijd voor de passage gliomaspheres, is het medium dat de gebieden verwijderd, geplaatst in een geschikte grootte steriele kweekbuis, en gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- De supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd van gebieden in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA en geïncubeerd bij 37 ° C in een waterbad gedurende 3-5 min.
- Een gelijk volume sojaboontrypsineremmer wordt vervolgens gebruikt om de trypsine te beëindigen.
- De celsuspensie wordt voorzichtig gepipetteerd op en neer om homogeniteit en volledige neutralisering van de trypsine-activiteit te garanderen.
- De celsuspensie wordt opnieuw gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten. De supernatant wordt verwijderd en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml NeuroCultNSC Basal Medium.
- 10 pl van de single-celsuspensie wordt gemengd met 90μl van trypan blauw om een celgetal voeren.
2. Kleuring met Cell Trace carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) Green Fluorescent Dye
- Per 1 miljoen cellen gekleurd is, wordt 1 ml van kleuring reagens bereid door toevoeging van 1 pi 5 mM Cell Trace CFSE kleurstof (Molecular Probes, Invitrogen) met 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 kleuring geven uM .
- De kleuring reagens dat de cellen goed gemengd tot homogeniteit en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Tijdens de incubatie wordt ijskoude NeuroCult NSC Basal Medium bereid als quenching oplossing.
- De kleuring te stoppen, wordt ongeveer 5-10 volumes van ijskoud quenching oplossing toegevoegd aan de CFSE-beladen cellen.
- De oplossing wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten en het supernatant wordt weggegooid.
- Op eis punt moet er verschijnt een pellet van cellen op de bodem van de buis met een heldere groene tint van kleur, waarin de kleuring is geslaagd.
- De cellen worden gewassen door opnieuw suspenderen van de pellet in 1-2 ml vers NeuroCult NSC Basal Medium, centrifugeren bij 800 rpm gedurende 5 minuten en de supernatant. Deze procedure wordt herhaald voor een totaal van drie wasbehandelingen.
- Na de derde wassen worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van NeuroCult NSC basismedium en een celgetal uitgevoerd.
- De CFSE gekleurde cellen worden vervolgens uitgeplaat in steriele weefselkweekflessen bij een geschikte dichtheid [50.000 cellen / ml] en in een 37 ° C / 5% CO2 bevochtigde incubator.
3. CFSE Laden Verificatie
- Cellen uitgeplaat in NSA cultuur kan worden gecontroleerd onder een fluorescentiemicroscoop met CFSE kleuring verifiëren. In dit stadium alle cellen vertonen heldergroene kleur (figuur 1). Als alternatief, een druppel van de suspensie vanCFSE gekleurde cellen kunnen worden op een microscoopglaasje en bedekt met een dekglaasje om cellen te visualiseren onder de fluorescentiemicroscoop.
- Succesvolle CFSE labeling wordt verder bevestigd via flowcytometrie. Zoveel als 1-5 x 10 5 cellen uit elke groep voldoende voor CFSE kleuring verificatie. De CFSE geladen en ongeladen cellen negatieve controle cellen respectievelijk geresuspendeerd in 1 x PBS-of NeuroCult NSC Basal Medium voor een totaal volume van 500 ul en in aparte buizen FACS.
- De flowcytometer is aangepast op basis van de handleiding instructies parameters. CFSE heeft een golflengte excitatie maximum van 492 nm en emissie maximum van 517 nm.
- Eerst worden de onbelaste controle cellen uitgevoerd en de verkregen events worden in voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (FSC vs SSC) en histogram plots en de belangrijkste celpopulatie gated (Figuur 2A).
- Evenzo worden de CFSE beladen cellen geanalyseerd met dezelfde parameters voor controle cellen (Figuur 2B).
4. Isolatie van de Slow-delende [dwz CFSE Behoud] Cel Bevolking Met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS)
- Na splitsing wordt CFSE-intensiteit verlaagd en hGBM cellen vormen gliomaspheres die zijn samengesteld uit cellen vertonen verschillende groene fluorescentie intensiteit (Figuur 3). Wanneer de gliomaspheres hebben een gemiddelde grootte van ongeveer 150 tot 200 micrometer in diameter (ongeveer 5 tot 10 dagen na CFSE loading afhankelijk van de cellijn groei) bereikt, wordt het medium dat de bollen verwijderd, geplaatst in een geschikte grootte steriele weefselkweek buis en gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Een enkele celsuspensie wordt bereid zoals beschreven in voorafgaande stappen en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in PBS voor een celtelling om een celsuspensie te bereiden met een dichtheid tot 10 7 cellen per milliliter.
- Achteruiter opnieuw suspenderen van de cellen in een geschikt volume PBS wordt propidiumjodide (PI, Sigma, 500 ug / ml) toegevoegd in een concentratie van 1 pi / ml celsuspensie om dode cellen uit te sluiten wanneer gesorteerd / geanalyseerd door doorstroomcytometrie.
- Twee 15 ml steriele kweekbuisjes die elk 1 ml volledig NeuroCult NSC Medium wordt gebruikt om de gesorteerde slow-delende cellen (CFSE behoud cellen) en de snel delende cellen (CFSE verdunning cellen) te verzamelen.
- Eerst wordt de celsuspensie uit de onbelaste celgroep lopen door de flowcytometer.
- De cellen (events) uitgezet op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) en spanning parameters voor beide parameters zodanig aangepast dat de meerderheid van de cellen in de stroom plot.
- Om dode of beschadigde cellen uit te sluiten, worden de cellen uitgezet op basis van SSC versus PI reactiviteit en de single live-celpopulatie (PI negatief) is omheind.
- Vervolgens wordt een homogene celpopulatie geselecteerd op forward verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC).
- De homogene enkele levende cel populatie wordt dan uitgezet in een histogram op basis van cel-frequentie versus CFSE intensiteit ingesteld op een logaritmische schaal. De CFSE laser intensiteit wordt aangepast om het negatieve signaal tussen 0 en 100 plaatsen.
- Met dezelfde parameters en een vergelijkbare gating strategie worden de CFSE gemerkte cellen lopen door de stromingscytometer en geanalyseerd (Figuur 4C).
- Vervolgens wordt een langzame delende populatie van cellen en een totale populatie (sneller delende cellen) geïdentificeerd op basis van hun vermogen om CFSE (CFSE hoge top 5% en CFSE laag bodem 85%, respectievelijk) behouden.
- Deze verschillende celpopulaties worden vervolgens gesorteerd in afzonderlijke 15 ml steriele weefselkweek buizen met 1 ml van complete NSC medium.
- Gesorteerde cellen gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten.
- Supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in een gepassende volume medium (afhankelijk van het aantal afzonderlijke gebeurtenissen of korrelgrootte) en een celgetal uitgevoerd.
- Cellen van de verschillende populaties gesorteerd vervolgens uitgeplaat bij 50.000 cellen per milliliter in een geschikte steriele weefselkweekfles en geplaatst in een 37 ° C / 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 5-10 dagen voordat zij opeenvolgend doorgekweekt of voor downstream experimenten.
5. Representatieve resultaten
Na CFSE laden alle cellen presenteren een intense groene fluorescentie gevisualiseerd onder de microscoop (Figuur 1). Deze groene getinte kleur te zien zelfs met het blote oog (zie video). Analyse van deze cellen met flowcytometrie toont ook zeer intense groene fluorescentie vergeleken met controle cellen (Figuur 2). Bij plating CFSE geladen cellen in neurosfeer cultuur, deze cellen prolifereren en vormen 150 tot 200 micrometer gliomaspheres in 5-10 dagen. De cellen prolifereren, t hij fluorescerende kleurstof gelijkelijk verdeeld tussen dochtercellen op divisies leidt tot de halvering van de fluorescentie-intensiteit bij elke celdeling. Glioblastomas zijn functioneel heterogene en zijn samengesteld uit cellen prolifereren op verschillende tijdschalen. De werkwijze beschreven in dit protocol laat toe identificeren en snel en langzaam delende cellen te isoleren door hun vermogen om te verdunnen of te behouden CFSE respectievelijk (Figuur 3, zie ook de video).
Flowcytometrieanalyse van gedissocieerde gliomaspheres gegenereerd door CFSE-beladen cellen in vergelijking met onbelaste cellen toont diverse CFSE retentie-eigenschappen (Figuur 4). Snel delende cellen (onderste 85%) of langzaam delende cellen (de top 5% - CFSE hoog) exhibit gliomapshere vormend vermogen indien gekweekt in de neurosfeer assay omstandigheden (figuur 5).
guur 1 "/>
Figuur 1. Gedissocieerde tumorcellen direct na belading met CFSE kleurstof. De cellen vertonen felle groene kleur te tonen succesvol etikettering. Originele vergroting, 10 x.
Figuur 2. CFSE Bevestiging laden met behulp van flowcytometrie. A) ongeladen cellen, B) CFSE geladen cellen en c) het vergelijken CFSE fluorescentie-intensiteit in beladen versus onbelast cellen. Merk op dat er verscheidene grootteordes verschil in fluorescentie-intensiteit tussen de gelabelde en ongelabelde cellen.
Figuur 3. Een vertegenwoordiger gliomasphere afgeleid van een CFSE beladen cel 6 dagen na uitplaten. Sommige cellen vertonen zeer lichte CFSE kleuring. Originele vergroting, 63 x.
Figuur 4. Representatieve flowcytometrie plaatsen / histogrammen voor isolatie van snelle en trage delende cellen 6 dagen na CFSE kleuring. A) FSC vs SSC de gehele celpopulatie tonen, B) SSC vs PI reactiviteit van dode of beschadigde cellen uitsluiten C) FSC vs SSC tot poort homogene levende celpopulatie, D) toont de aanwezigheid van CFSE behouden cellen 6 dagen na CFSE labeling zoals blijkt uit een hogere fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de negatieve controle. Het histogram geeft ook aan dat de CFSE intensiteit vervallen na verloop van tijd. E) Histogram weergave van de gating strategie om CFSE behoud van cellen (top 5%) en CFSE verdunnen cellen (onderste 85%) te identificeren.
Figuur 5. Representatieve gliomaspheres gegenereerd
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steeds studies hebben het belang aangetoond van een langzaam delende sub-compartiment van cellen in kanker die bijdragen tot tumorvorming en behandeling weerstand 2-8. Daarom is het essentieel om te beschrijven en te standaardiseren experimentele methoden waarmee de studie van deze specifieke subpopulatie van cellen of meer in het algemeen om subpopulaties te vergelijken met verschillende groeicijfers. Met behulp van CFSE te identificeren en te isoleren sub-fracties van cellen op basis van hun snelheid van celdeling is een startpunt om verder te karakteriseren deze specifieke cellulaire fracties, waardoor ons begrip van de heterogeniteit beschreven in tumoren bevorderen. In dit protocol hebben we het voorbeeld van het identificeren en isoleren van een slow-delende populatie in glioblastoma, maar dit protocol kan ook worden toegepast op andere tumorcellen, waaronder en niet beperkt tot borst-, pancreas en huidkanker. Stroomafwaarts analyse van deze populaties kan worden uitgevoerd en kunnen bestaan uit functional studies waarin proliferatieve potentieel 2, tumorvorming mogelijkheid 2, behandeling gevoeligheid, en (epi) genetische vergelijkingen. Deze methode kan ook worden gebruikt met niet-kanker systemen en kan worden toegepast, bijvoorbeeld somatische stam / voorlopercellen.
Kritische technische aspecten in de procedure die voldoende dissociatie van cellen met trypsine en voldoende resuspensie van cellen in de kleu om een goede dichtheid vaststellen en homogene kleuring. Een klein monster van vers gekleurde cellen worden gecontroleerd door flowcytometrie homogene kenmerken gekenmerkt door een Gauss-achtige smal profiel (zie figuur 2B) te waarborgen. In het geval van heterogene labeling eerste kan een voorsorteren worden uitgevoerd om piek resolutie te verbeteren met geringer aantal CFSE fluorescentie. Toch moet ervoor worden gezorgd dat deze pre-soort niet te selecteren voor specifieke maten. Het gebruik van propidiumjodide (PI) etikettering iELANGRIJKE voor het identificeren levende cellen en dode / beschadigde populatie verwijdering van de be-poort, door de tendens dode cellen kan introduceren in stroomafwaartse toepassingen. Opgemerkt het bijzonder hoge fluorescentie-intensiteit van de CFSE labeling en de mogelijke pijn naar andere kanalen bij gebruik naburige fluorochromen in het spectrum zoals het fluorochroom fycoerythrine (PE). Het is van cruciaal belang op te merken dat multiplex etikettering experimenten met CFSE en fluorochroom-geconjugeerde antilichamen kunnen een vergoeding proces nodig bij de aankoop of analysetijd. Zorg ervoor dat u alle noodzakelijke controles die ongekleurde cellen (die het niveau van de autofluorescentie), afzonderlijk gekleurde cellen en uw specifieke combinatie omvatten hebben. Meerdere kleuren labeling in combinatie met CFSE werkt het beste fluorochromen zoals Pacific Blue of allofycocyanine (APC). Als het doel van het experiment is om het absolute aantal celdelingen kwantificeren over een bepaalde periode van tijd, het CFSE gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) moet worden gemeten op minimaal twee verschillende tijdstippen 2 met de eerste ten minste 24 uur na CFSE loading. CFSE-intensiteit drastisch verlaagt binnen de eerste 24 uur in afwezigheid van celdeling maar stabiliseert en vermindert ten opzichte van celdeling. Het moet ook een controle met niet-proliferatieve CFSE beladen cellen die de basislijn voor CFSE-intensiteit verval niet gerelateerd aan celdeling omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Florida Center for Brain Tumor Research, de Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapie en de National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
