Identificazione e isolamento di Slow-divisione delle cellule nel glioblastoma umano per mezzo di Carboxy fluoresceina succinimidile Ester (CFSE)
Summary
Questo protocollo video dimostra l'applicazione del colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) per l'identificazione e la separazione di differenti sottopopolazioni di cellule di glioblastoma umano basati sulla frequenza di divisione cellulare.
Abstract
Eterogeneità tumorale rappresenta una caratteristica fondamentale di supporto robustezza tumore e presenta un ostacolo centrale per lo sviluppo di strategie terapeutiche 1. Per superare il problema della eterogeneità tumorale, è essenziale sviluppare saggi e strumenti che consentono fenotipica, (epi) identificazione genetica e funzionale e caratterizzazione di sottopopolazioni tumorali che guidano patologie malattie specifiche e rappresentano obiettivi clinicamente rilevanti. È ormai noto che i tumori esporre distinti sotto-frazioni di cellule con differenti frequenze di divisione cellulare, e che i criteri funzionali essendo ciclo lento è correlata positivamente con capacità di formazione di tumori in diversi tumori inclusi quelli del cervello, la mammella, della pelle e pancreas così come la leucemia 2-8. Il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) è stato utilizzato per il monitoraggio della frequenza di divisione delle cellule in vitro e in vivo in ematica tumors e tumori solidi come il glioblastoma 2,7,8. La cellula-permeant non fluorescente pro-farmaco di CFSE viene convertito da esterasi intracellulari in un composto fluorescente, che è trattenuta all'interno delle cellule da covalentemente legame alle proteine per reazione della sua porzione succinimidil con gruppi amminici intracellulari di formare legami ammidici stabili 9. Il colorante fluorescente è equamente distribuito tra cellule figlie upon divisioni, portando alla dimezzamento dell'intensità di fluorescenza con ogni divisione cellulare. Ciò consente il monitoraggio della frequenza del ciclo cellulare fino a otto-dieci giri di divisione 10. Capacità di ritenzione CFSE è stato utilizzato con le cellule tumorali del cervello per identificare e isolare una sottopopolazione lento in bicicletta (top 5% dye-fissaggio celle) ha dimostrato di essere arricchito in attività delle cellule staminali del cancro 2.
Questo protocollo descrive la tecnica di colorazione delle cellule con CFSE e l'isolamento di singole popolazioni in una cultura umana glioblastoma (GBM) derivati da cellule che posseggono differenti tassi di divisione in citometria a flusso 2. La tecnica è servito per identificare e isolare un tumore lento ciclismo popolazione di cellule cerebrali in virtù della loro capacità di trattenere l'etichettatura CFSE.
Protocol
Discussion
Un numero crescente di studi hanno dimostrato l'importanza di una lenta separazione sub-compartimento di cellule nel cancro che contribuiscono alla formazione di tumori e di resistenza al trattamento 2-8. Pertanto è fondamentale per descrivere e standardizzare metodi sperimentali che consentano lo studio di questa sottopopolazione di cellule o più in generale per confrontare sottopopolazioni con differenti tassi di crescita. Utilizzando CFSE per identificare e isolare sotto-frazioni di cellule in base a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro per la Ricerca Florida Tumore al cervello, il Preston A. Wells Jr. Centro per la Terapia Tumore al cervello e il National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
References
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