تحديد وعزل بطيئة تقسيم الخلايا في الإنسان عن طريق ورم أرومي دبقي كربوكسي فلوريسئين Succinimidyl استر (CFSE)
Summary
هذا الفيديو يشرح بروتوكول تطبيق صبغة الفلورسنت استر succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) لتحديد وفصل السكان الفرعية المختلفة من الخلايا في ورم أرومي دبقي الإنسان على أساس تواتر انقسام الخلايا.
Abstract
عدم التجانس الورم يمثل سمة أساسية دعم متانة الورم ويشكل عائقا أساسيا في وضع استراتيجيات علاجية 1. للتغلب على مسألة عدم التجانس الورم، فمن الضروري لتطوير المقايسات وأدوات تمكينية المظهري، (EPI) تحديد الوراثية والوظيفية وتوصيف المجموعات السكانية الفرعية التي تدفع الأمراض السرطانية مرض محدد، وتمثل الأهداف ذات الصلة سريريا. والآن راسخة أن الأورام تظهر متميزة الفرعية كسور الخلايا مع ترددات مختلفة من انقسام الخلايا، والذي يرتبط بشكل إيجابي على معايير وظيفية يجري الدراجات بطيئة مع القدرة تشكيل الورم في سرطان عدة بما في ذلك الدماغ والجلد والثدي و البنكرياس وكذلك سرطان الدم 2-8. تم استخدام صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لتتبع وتيرة انقسام الخلايا في المختبر والمجراة في الدم المنقولة رumors والأورام الصلبة مثل ورم أرومي دبقي 2،7،8. يتم تحويل الخلايا نفيذ غير الفلورسنت المؤيدة لتعاطي المخدرات من قبل CFSE الاسترات داخل الخلايا إلى مجمع الفلورسنت، والتي يتم الاحتفاظ داخل الخلايا بواسطة ملزمة تساهميا إلى البروتينات من خلال رد فعل شاردة في succinimidyl مع مجموعات أمين الخلايا لتشكيل السندات مستقرة أميد 9. موزعة بالتساوي بين صبغة الفلورسنت الخلايا الوليدة على الانقسامات، مما أدى إلى بمقدار النصف من شدة التألق مع كل انقسام الخلية. وهذا يتيح تتبع دورة الخلية تردد تصل إلى 8-10 جولات من تقسيم 10. وقد استخدم CFSE القدرة على الاحتفاظ بخلايا ورم في المخ لتحديد وعزل جزء من السكان الدراجات بطيئة (أعلى 5٪ صبغ الاحتفاظ الخلايا) أظهرت لتخصيبه في نشاط الخلايا الجذعية السرطانية 2.
يصف هذا البروتوكول أسلوب تلطيخ الخلايا مع CFSE وعزل السكان الفردية ضمن ثقافة الإنسان الدبقأرومي (GBM) الخلايا المشتقة امتلاك معدلات مختلفة باستخدام تقسيم التدفق الخلوي 2. وقد خدم هذه التقنية لتحديد وعزل ورم دماغي بطيء الدراجات السكان من الخلايا بحكم قدرتها على الإبقاء على وضع العلامات CFSE.
Protocol
Discussion
وقد أظهرت عددا متزايدا من الدراسات على أهمية وجود حجرة الفرعية بطيئة تقسيم الخلايا في سرطان التي تسهم في تشكيل الورم والعلاج المقاومة 2-8. ولذلك فمن الأهمية بمكان لوصف وتوحيد الطرق التجريبية تمكن دراسة هذه حيوانية معينة من الخلايا أو أكثر لمقارنة مجموعات سكاني?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مركز فلوريدا لأبحاث استئصال ورم من الدماغ، وA. بريستون ويلز الابن مركز للعلاج استئصال ورم من الدماغ والمعاهد الوطنية للصحة (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
