Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE)
Summary
Deze video protocol toont de toepassing van de fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voor de identificatie en scheiding van verschillende sub-populaties van cellen in humane glioblastoma gebaseerd op de frequentie van de celdeling.
Abstract
Tumor heterogeniteit is een fundamenteel kenmerk ondersteunende tumor robuustheid en presenteert een centrale belemmering voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën 1. Te overwinnen het probleem van tumor heterogeniteit is het noodzakelijk dat assays en instrumenten waarmee fenotypische, (epi) genetische en functionele identificatie en karakterisatie van tumor subpopulaties die specifieke ziekte pathologieën rijden en klinisch relevante doelen. Het is nu bekend dat tumoren vertonen verschillende deelfracties van cellen met verschillende frequenties van celdeling, en de functionele criterium dat langzaam fietsen positief geassocieerd met tumorvorming vermogen in verschillende kankers waaronder die van de hersenen, borst, huid en pancreas en leukemie 2-8. De fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) is gebruikt voor het volgen van de verdeling frequentie van cellen in vitro en in vivo in bloed overgedragen tumors en vaste tumoren zoals 2,7,8 glioblastoma. De cel-permeant niet fluorescerend pro-drug van CFSE omgezet door intracellulaire esterasen in een fluorescente verbinding, die binnen cellen vastgehouden door covalente binding aan eiwitten door reactie van de succinimidyl groep met intracellulaire aminegroepen vormen stabiele amidebindingen 9. De fluorescerende kleurstof wordt gelijkelijk verdeeld tussen dochtercellen op divisies leidt tot de halvering van de fluorescentie-intensiteit bij elke celdeling. Dit maakt het volgen van celcyclus frequentie tot acht tot tien ronden van sector 10. CFSE retentie capaciteit werd gebruikt met hersentumor cellen te identificeren en te isoleren van een langzaam fietsen subpopulatie (top 5% kleurstof-behoud van cellen) aangetoond worden verrijkt in kankerstamcel activiteit 2.
Dit protocol beschrijft de techniek van gekleurde cellen met CFSE en isolatie van afzonderlijke populaties in een cultuur van menselijke glioblastoom (GBM)-afgeleide cellen bezitten verschillende divisie tarieven met behulp van flowcytometrie 2. De techniek heeft gediend te identificeren en een hersentumor langzaam cycling populatie van cellen te isoleren door hun vermogen om de CFSE labeling behouden.
Protocol
Discussion
Steeds studies hebben het belang aangetoond van een langzaam delende sub-compartiment van cellen in kanker die bijdragen tot tumorvorming en behandeling weerstand 2-8. Daarom is het essentieel om te beschrijven en te standaardiseren experimentele methoden waarmee de studie van deze specifieke subpopulatie van cellen of meer in het algemeen om subpopulaties te vergelijken met verschillende groeicijfers. Met behulp van CFSE te identificeren en te isoleren sub-fracties van cellen op basis van hun snelheid van ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Florida Center for Brain Tumor Research, de Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapie en de National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
References
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
