Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle
Summary
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nutzung der inhärenten Fähigkeit von Stammzellen zu Stichwort von der sie umgebenden extrazellulären Matrix induziert nehmen und in mehrere Phänotypen zu unterscheiden. Dieses Verfahren erweitert unser Manuskript Beschreibung und Charakterisierung eines Modells unter Verwendung einer zweischichtigen Hydrogel, von PEG-Fibrin und Kollagen zusammen, um gleichzeitig Co-differenzieren Fettgewebe gewonnene Stammzellen<sup> 1</sup>.
Abstract
Natürliche Polymere im Laufe der Jahre haben mehr Bedeutung wegen ihrer Biokompatibilität und Host-Fähigkeit, mit Zellen in vitro und in vivo interagieren gewonnen. Ein Forschungsgebiet, das Versprechen hält in der regenerativen Medizin ist die kombinatorische Verwendung von neuartigen Biomaterialien und Stammzellen. Eine grundlegende Strategie im Bereich des Tissue Engineering ist die Verwendung von dreidimensionalen Gerüst (zB dezellularisiert extrazellulären Matrix, Hydrogele, Mikro / Nanopartikel) zum Richten Zellfunktion. Diese Technologie wurde von der Entdeckung, dass die Zellen entwickelt ein Substrat, auf dem sie anhaften können müssen, proliferieren und drücken ihre differenzierten zelluläre Phänotyp und Funktion 2-3. In jüngerer Zeit wurde auch festgestellt, dass Zellen nicht nur diese Substrate für die Einhaltung, sondern auch interagieren und unter dem Einfluss dieser Matrixsubstrat (zB extrazelluläre Matrix, ECM) 4. Daher müssen die Zellen und Gerüsten eine gegenseitige Verbindung,dient dazu, Gewebe-Entwicklung, Organisation und ultimative Funktion zu kontrollieren. Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sind mesenchymale, präsentieren nicht-hämatopoetischen Stammzellen im Fettgewebe, die Multi-Linie Differenzierung aufweisen können und dienen als leicht verfügbare Quelle von Zellen (dh vor der vaskulären Endothelzellen und Perizyten). Unsere Hypothese ist, dass aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen zu unterschiedlichen Phänotypen gleichzeitig einfach durch Co-Kultivierung ihnen in zweischichtigen Matrices 1 gerichtet werden kann. Unser Labor ist auf die dermale Wundheilung konzentriert. Zu diesem Zweck haben wir einen einzigen zusammengesetzten Matrix aus den natürlichen Biomaterialien, Fibrin, Kollagen und Chitosan, die die Eigenschaften und Funktionen eines dermo-spezifischen Wundheilung ECM-Umgebung nachahmen kann.
Protocol
Discussion
ASC werden aufgrund ihrer einfachen der Isolierung und die Fähigkeit, gegenüber verschiedenen Zelltypen differenzieren bekannt. Mit den Techniken, die in diesem Manuskript beschrieben, sind wir in der Lage, die Plastizität der ASC, indem diese Zellen auf mehrere Biomatrices gleichzeitig zu nutzen. Wie Zellen wandern weg von ihren CSM Basis und geben sie umgebenden extrazellulären Umgebung, nehmen die Zellen Cue vom Gerüst und kann entweder zu halten "Stammzell-Seins" (Kollagen) oder induziert in Richtung …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN wurde von einem Postdoctoral Fellowship Grant von der Pittsburgh Tissue Engineering Initiative unterstützt. DOZ wird durch einen Zuschuss aus der Genfer Stiftung unterstützt.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
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