Инжиниринг двухслойных гидрогель для управления ASC дифференциации
Summary
Этот протокол фокусируется на использовании врожденной способности стволовых клеток брать пример с окружающих их внеклеточный матрикс и вызвать их дифференцировку в несколько фенотипов. Это методы рукопись расширяет наше описание и характеристика модели использования двухслойных гидрогель, состоящий из PEG-фибрин и коллаген, одновременно совместно дифференцировать жировой ткани стволовых клеток<sup> 1</sup>.
Abstract
Природных полимеров на протяжении многих лет приобрели большее значение из-за их биосовместимостью хозяина и способность взаимодействовать с клетками, в пробирке и в естественных условиях. Область исследований, которая держит обещание в регенеративной медицине комбинаторной использование новых биоматериалов и стволовых клеток. Основная стратегия в области тканевой инженерии является использование трехмерных леса (например, decellularized внеклеточного матрикса, гидрогели, микро / нано частиц) для направления клеточной функции. Эта технология прошла путь от открытия, что клетки должны подложки, на которой они могут придерживаться, размножаться, и выражать свои дифференцированные клеточный фенотип и функции 2-3. Совсем недавно было также установлено, что клетки не только использовать эти субстраты для присоединения, а также взаимодействовать и принимать сигналы с матрицы подложки (например, внеклеточный матрикс, ECM) 4. Таким образом, клетки и леса имеют взаимные связи, чтослужит для контроля тканей развитию, организации и конечная функция. Жировая производные стволовые клетки (ИСС) являются мезенхимальные, не кроветворения стволовые клетки, присутствующие в жировой ткани, что может выставить несколько линия дифференциации и служить доступный источник клеток (т.е. предварительно сосудистой эндотелия и перицитов). Наша гипотеза состоит в том, что жировая стволовых клеток могут быть направлены на различные фенотипы одновременно просто совместного культивирования их в двухслойных матриц 1. Наша лаборатория ориентирована на кожный заживления ран. С этой целью мы создали один составной матрицы от природных биоматериалов, фибрин, коллаген и хитозан, которые могут имитировать характеристики и функции кожного конкретных раны окружающей среды исцеления ECM.
Protocol
Discussion
ИСС хорошо известны за их простоту изоляции и способность различать на различные типы клеток. С методами, описанными в этой рукописи, мы можем использовать пластичность ИСС, подвергая эти клетки на несколько biomatrices одновременно. Как клетки мигрируют от их CSM базу и ввести окружающих их ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Н. была поддержана Грантом Докторантура стипендий от инженерной инициативы тканей Питтсбурге. ДОЗ поддерживается гранта от Фонда Женеве.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Natesan, S. A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation. Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. , (2008).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, M. C. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Zhang, G. A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery. Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Zhang, G. Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix. Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).
- Rochon, M. H. Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries. Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
