Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC
Summary
Este protocolo é focado na utilização a capacidade inerente de células estaminais para tomar cue a partir de sua matriz circundante extracelular e ser induzidas a diferenciar-se em múltiplos fenótipos. Este manuscrito métodos estende nossa descrição e caracterização de um modelo utilizando um hidrogel de camada dupla, composto de PEG-fibrina e colagénio, ao mesmo tempo, co-diferenciar células-tronco adiposas<sup> 1</sup>.
Abstract
Polímeros naturais ao longo dos anos ganharam mais importância devido à sua biocompatibilidade hospedeiro e capacidade de interagir com células in vitro e in vivo. Uma área de investigação que tem a promessa em medicina regenerativa é o uso combinatória de novos biomateriais e células estaminais. Uma estratégia fundamental no campo da engenharia de tecidos é o uso de tridimensional andaime (por exemplo, descelularizados matriz extracelular, hidrogéis, micro / nano partículas) para dirigir a função da célula. Esta tecnologia tem evoluído a partir da descoberta de que as células precisam de um substrato sobre o qual podem aderir, proliferar, e expressar seu fenótipo diferenciado celular e função 2-3. Mais recentemente, tem sido também determinado que as células não só a utilização destes substratos para a adesão, mas também interagir e tomar pistas a partir do substrato da matriz (matriz, por exemplo, extracelular, ECM) 4. Portanto, as células e andaimes ter uma ligação recíproca queserve para controlar o desenvolvimento do tecido, organização e função final. As células-tronco adiposas (ASC) são mesenquimais, as células estaminais hematopoiéticas não-apresentar no tecido adiposo que podem exibir multi-linhagem diferenciação e servir como uma fonte prontamente disponível de células (isto é pré-vascular endotélio e pericitos). Nossa hipótese é que as células-tronco derivadas de tecido adiposo pode ser direcionado para diferentes fenótipos simultaneamente, bastando co-cultura-los em matrizes bifásicos 1. O nosso laboratório é focado sobre a cicatrização de feridas dérmica. Para este fim, foi criada uma única matriz composta a partir de os biomateriais naturais, fibrina, colagénio, quitosano e que pode imitar as características e funções de um ambiente de cicatrização da ferida dérmica específico ECM.
Protocol
Discussion
ASC são bem conhecidos pela sua facilidade de isolamento e capacidade de diferenciar para vários tipos de células. Com as técnicas descritas neste manuscrito, somos capazes de explorar a plasticidade da ASC por expor essas células para biomatrices múltiplos simultaneamente. Como as células migram para longe de sua base CSM e entrar no seu meio ambiente extracelular, as células tomar sugestão do andaime e pode manter "stemness" (colágeno) ou ser induzido a diferenciar os tipos de células para vascula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SN foi apoiado por uma bolsa pós-doutorado da Iniciativa Engenharia de Tecidos Pittsburgh. DOZ é apoiado por uma subvenção concedida à Fundação de Genebra.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm Nylon Mesh Filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C8106 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-Oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | Consumable |
| Thrombin | Sigma | T6884 | Consumable |
| Benztriazole Derivative of Polyethylene | Sunbio | DE-034GS | Consumable |
| Tris Buffer Tablet (pH 7.6) | Sigma | T5030 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
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