Engineering A Bilayered Hydrogel å kontrollere ASC differensiering

Summary

Denne protokollen fokuserer på å utnytte den iboende evne stamceller til å ta signalet fra sin omkringliggende ekstracellulær matrix og bli overtalt til å differensiere i flere fenotyper. Dette metoder manuskript utvider vår beskrivelse og karakterisering av en modell utnytte en bilayered hydrogel, sammensatt av PEG-fibrin og kollagen, å samtidig co-differensiere adipose-avledet stilk celler¹.

Abstract

Naturlige polymerer i løpet av årene har fått mer betydning på grunn av sin vert biokompatibilitet og evne til å samhandle med celler in vitro og in vivo. Et område av forskning som holder løftet i regenerativ medisin er kombinatorisk bruk av nye biomaterialer og stamceller. En grunnleggende strategi innen tissue engineering er bruken av tre-dimensjonale stillaset (f.eks decellularized ekstracellulær matrix, hydrogeler, mikro / nano partikler) for regi celle funksjon. Denne teknologien har utviklet seg fra oppdagelsen at celler trenger et substrat hvorpå de kan feste seg, spre seg, og uttrykke sin differensiert cellulær fenotype og funksjon ^2-3. Mer nylig har det også blitt bestemt at cellene ikke bare bruke slike underlag for tilhørighet, men også samhandle og ta signaler fra matrisen underlag (f.eks ekstracellulær matrix, ECM) ^4. Derfor cellene og stillaser har en gjensidig forbindelse somtjener til å styre vev utvikling, organisering, og ultimate funksjon. Er adipose-avledet stilk celler (ASCs) mesenchymale, ikke-hematopoetic stamceller som finnes i fettvev som kan vise multi-avstamning differensiering og tjene som en lett tilgjengelig kilde til celler (dvs. pre-vaskulær endothelia og pericytes). Vår hypotese er at adipose-avledet stilk celler kan være rettet mot ulike fenotyper samtidig ved å co-dyrkning dem i bilayered matriser ^1. Vårt laboratorium er fokusert på dermal sårtilheling. Til dette formålet har vi opprettet en enkelt sammensatt matrise fra de naturlige biomaterialer, fibrin, kollagen, og kitosan som kan etterligne egenskapene og funksjonene til en dermal-spesifikk sårtilheling ECM miljø.

Protocol

1. Isolere adipose-avledet stilk celler (ASCs) 1, 5 Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt. Isoler rotte perirenal og epididymal adipose og vask med sterilt Hank bufret salt-løsning (HBSS) inneholder 1% fosterets storfe serum (FBS) som tidligere beskrevet fem. Denne studien er gjennomført i samsvar med dyrevernloven, gjennomføringsreglene dyrevernnemnder forskrift og i samsvar med prinsippene i Guide …

Discussion

ASCs er godt kjent for sin enkle isolasjon og evne til å skille mot ulike celletyper. Med de teknikkene som beskrives i dette manuskriptet, er vi i stand til å utnytte plastisitet av ASCs ved å utsette disse cellene til flere biomatrices samtidig. Som celler migrere bort fra deres CSM basen og inn i sitt omkringliggende ekstracellulært miljø, cellene ta signalet fra stillaset og kan enten opprettholde "stemness" (kollagen) eller bli overtalt til å differensiere mot vaskulære-og vaskulær-støttende cell…

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number	Comments
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Consumable
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consumable
70-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consumable
100-μm Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consumable
MesenPRO Growth Medium System	Invitrogen	12746-012	Consumable
L-Glutamine	Gibco	25030	Consumable
CaCl2.2H2O	Sigma	C8106	Consumable
T75 Tissue Culture Flask	BD Biosciences	137787	Consumable
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consumable
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Consumable
N-Octanol	Acros Organics	150630025	Consumable
Sorbitan-Mono-Oleate	Sigma-Aldrich	S6760	Consumable
Potassium Hydroxide	Sigma-Aldrich	P1767	Consumable
Acetone	Fisher Scientific	L-4859	Consumable
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741	Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid	Sigma-Aldrich	P2297	Consumable
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	320331	Consumable
Ethyl Ether	Sigma-Aldrich	472-484	Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts	BD Biosciences	353097	Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes	Fisher	05-408-129	Consumable
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit(Q Tracker 655)	Molecular probes	Q2502PMP	Consumable
Type 1 Collagen	Travigen	3447-020-01	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Consumable
12-Well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	Consumable
Fibrinogen	Sigma	F3879	Consumable
Thrombin	Sigma	T6884	Consumable
Benztriazole Derivative of Polyethylene	Sunbio	DE-034GS	Consumable
Tris Buffer Tablet (pH 7.6)	Sigma	T5030	Consumable
Centrifuge	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Shaker	New Brunswick Scienctific	C24	Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2	Thermo Scientific	Model 370	Equipment
Overhead Stirrer	IKA	Visc6000	Equipment
Magnetic Stirrer	Corning	PC-210	Equipment
Vacuum Desiccator	–	–	Equipment
Particle Size Analyzer	Malvern	STP2000 Spraytec	Equipment
Water Bath	Fisher Scientific	Isotemp210	Equipment
Spectrophotometer	Beckman	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spectrophotometer	Equipment
Vortex	Diagger	3030a	Equipment
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Equipment
Light/Fluorescence Microscope	Olympus	IX71	Equipment
Confocal Microscope	Olympus	FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope	Equipment
Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Leo 435 VP	Equipment
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEOL 1230	Equipment