Summary
Beskriver vi en fluorescens Reporter Assay til hurtigt at identificere og karakterisere gener, der regulerer muse embryonale stamceller vedligeholdelse og selvfornyelse.
Abstract
Pluripotency og selv-fornyelse er to definerende karakteristika af embryonale stamceller (ES-celler). Forstå den underliggende molekylære mekanisme vil i høj grad lette brugen af ES-celler for Developmental Biology undersøgelser, sygdom modellering, Drug Discovery, og regenerativ medicin (revideret i 1,2).
At fremskynde identifikation og karakterisering af hidtil ukendte regulatorer af ES-celle vedligeholdelse og selvfornyelse, udviklede vi en fluorescens reporter-baseret assay til kvantitativt at måle selvfornyelse status i muse ES-celler under anvendelse af Oct4GiP cellerne tre. De Oct4GiP celler udtrykker det grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af Oct4 genpromotorregion 4,5. Oct4 kræves for ES-celle selvfornyelse, og er overudtrykt i ES-celler og hurtigt nedreguleres under differentiering 6,7. Som et resultat korrelerer GFP-ekspression og fluorescens i reportergen-celler nøjagtigtmed ES-celle identitet 5, og fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)-analyse kan bruges til nøje at overvåge selvfornyelse status af cellerne på enkelt celle niveau 3,8.
Sammen med RNAi, kan Oct4GiP reporter analysen bruges til hurtigt at identificere og studere regulatorer af ES-celle vedligeholdelse og selvfornyelse 3,8. Sammenlignet med andre fremgangsmåder til assaybestemmelse selvfornyelse, er det mere bekvemt, følsom, kvantitativ, og lavere omkostninger. Det kan udføres på 96 - eller 384-brønds plader for omfattende undersøgelser, såsom høj-throughput skærme eller genetisk epistasis analyse. Endelig, ved hjælp af andre slægt-specifikke reporter ES-cellelinier, kan assayet er beskrevet her også modificeres til at studere skæbne specifikation i ES-celle-differentiering.
Protocol
1. Oct4GiP mus ES-celle vedligeholdelse
Oct4GiP celler blev venligst tilvejebragt af Dr. Austin Smith. De er afledt fra 129/Ola mus, der bærer en Oct4-GFPiresPac transgen 4,5. De fastholdes i gelatine-coatede vævskulturplader i ESGRO fuldstændig plus klonal grad medium (Millipore) eller i M15 medium: DMEM (Invitrogen) suppleret med 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x Ikke essentielle aminosyrer (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), og 10 uM β-mercaptoethanol.
- Overtrække pladerne med 0,1% gelatine (Sigma) ved stuetemperatur i 30 minutter (0,1 ml gelatineopløsning / cm 2).
- Plade Oct4GiP celler i gelatine-coatede plader ved ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Opdele cellerne hver anden dag med 0,05% trypsin.
2. siRNA Transfektion i Oct4GiP celler
Den Oct4GiP reporter assayet er mest conveniently udføres i gelatine-coatede fladbundet 96 - eller 384-brønds plader (Corning eller BD) i M15 medium. Den samlede fremgangsmåde er skitseret i figur 1..
- siRNA-lipid-komplekser samling:
- Til transfektion i 96-brønds plader, samles siRNA-lipid-komplekser i U-bund 96-brønds plader.
- I hver brønd, bland 10 pi OptiMEM (Invitrogen) og 0,3 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt 5 pmol siRNA til lipid-OptiMEM-blandingen og inkuberes i yderligere 15 minutter. Den siRNA: lipid-forholdet er 100 pmol: 6ul.
- Overfør siRNA-lipid komplekser i OptiMEM fra U-bundplade med gelatine-overtrukne fladbundede plader med en multi-kanal pipette.
- Til transfektion i 384-brønds plader, forbereder siRNA-lipid komplekser under anvendelse af 0,1 pi Lipofectamine 2000 og 2 pmol siRNA i 10 pi OptiMEM.
Note: Den endelige siRNA koncentration itransfektionerne er 50 nM. Gennemføre 3-4 biologiske replikater for hver siRNA transfektion. Nedsat master-blandinger af de siRNA-lipid komplekser i U-bundplade, og prøve i fladbundede gelatine-overtrukne plade.
- Oct4GiP celleudpladning og transfektion:
- Til transfektion i 96-brønds plader, indsamle Oct4GiP celler og resuspenderes dem i frisk M15 medium til 9 x 10 4 celler / ml.
- Tilsættes 100 pi af cellesuspensionen til hver brønd under anvendelse af en multi-kanal pipette.
- Bland cellesuspensionen med præ-alikvoter siRNA-lipider komplekser i brønden ved pipettering op og ned 3-5 gange. Skift tips til forskellige siRNA transfektioner.
- Til transfektion i 384-brønds plader, resuspender Oct4GiP celler til 6 x 10 4 celler / ml og aliquot 30 pi cellesuspension til hver brønd.
Bemærk: Den optimale celle udpladningsdensitet sædvanligvis 3 x 10 5 celler / cm 2, men may kræver yderligere optimering for siRNAs der dramatisk påvirker cellevækst eller levedygtighed. Lav udpladningsdensitet vil føre til dårlig celleoverlevelse under transfektion. Høj udpladningsdensitet vil føre til høj baggrund på grund af høj celle konfluens induceret differentiering. Eventuelt test udpladningsdensitet mellem 2-4 x 10 5 celler / cm 2.
- Medium ændring:
- Fjern gammelt medium ved hjælp af multi-kanal aspirator (Corning) eller vakuum Wand (VP-Scientific). Pas på ikke at ridse cellerne i bunden af pladerne.
- Foder cellerne med frisk ES-celle medium (100 pi til 96-brønds plade og 30 pi til 384 brønds-plade) ved anvendelse af multi-kanal pipette hver dag.
3. FACS-analyse
- Celledissociering:
- Fire dage efter transfektion, fjernes mediet ved anvendelse af multi-kanal aspirator (Corning) eller vakuum staven (VP-Scientific).
- For 96-brøndsplader, skylles cellerne en gang med 100μl PBS.
- Tilsættes 25 ul 0,25% trypsin til hver brønd under anvendelse af en multi-kanal pipette.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter med lejlighedsvis omrøring, og visuelt inspicere for at sikre fuldstændig frigørelse af cellerne.
- Tilsættes 90 ul PBS med 10% FBS til inaktivering af trypsin og dissociere celler i en enkelt cellesuspension ved gentagen pipettering.
- For 384-brønds plader, adskille celler med 10 pi trypsin og standses med 30 gl PBS med 10% FBS.
- FACS-analyse:
- Analyser GFP fluorescens på BD LSRII FACS analyseapparat udstyret med HTS enhed eller anden tilsvarende udstyret FACS analysator (såsom Accuri eller Intellicyt).
- Anvende højt gennemløb på HTS og analysere 10 pi af cellesuspensionen. Indstil tæller tærsklen til 1,0 x 10 4 celler.
- Juster PMT spænding og tærsklen for at fange celler i den forreste vs side-scatter plot. Gate for levende cellepopulation i forward vs side-scatter plot.
- Skabe et histogram plot for GFP kanal. Indstille port i GFP kanal, således at ~ 10% af cellerne synes at være GFP-negative i mock eller kontrol-siRNA transficerede celler.
- Bestemme% GFP-negative celler fra hver behandling:% differentierede celler =% GFP-negative celler. Sammenligne% Differentierede celler mellem eksperimentelle-og kontrol-siRNA transfektioner ved anvendelse af to-halet t-test, og scorer positive hits med p-værdier <0,01.
4. Repræsentative resultater
Oct4, Nanog og Sox2 er tre gener at spille kritiske roller i opretholdelse af ES-celle selvfornyelse 6,7,9-11. Figur 2 viser, at Oct4GiP Reporter Assay let kan detektere differentiering forårsaget af tavshed disse faktorer i Oct4GiP ES-celler.
Figur 2A viser Oct4GiP ES-cellerne er GFP-positive, når opretholdes ES celler. Figur 2B viser den forreste versus sidespredning plot og histogrammet for GFP kanalen af Oct4GiP celler transficeret med kontrol-eller Oct4-siRNAs. Det er nødvendigt at porten for levende celler i den forreste versus sidespredning plot, som døde celler og cellerester er GFP-negative og vil øge baggrund. På den anden side, diskrimination dublet at udelukke mulige celleklumper ikke altid nødvendig. I kontrol-siRNA transficerede celler, skal de fleste af cellerne er GFP-positive. Hvis åbenlyse GFP-negative populationer er til stede i de kontrol-siRNA transficeret brønde, kan de startende Oct4GiP celler eller transfektion procedure er blevet kompromitteret, og resultatet kan ikke være fortolkelige.
Figur 2C viser søjlediagram af% Differentierede celler (% Differentierede celler =% GFP-negative celler) fra kontrol-, Oct4-, Nanog-og Sox2-siRNA transficerede celler.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Figur 1. Oversigt over Oct4GiP reporter assay.
Figur 2. Oct4GiP reporter assay kan detektere ES-celle differentiation som følge af Nanog, Oct4 eller Sox2 silencing. A) E14Tg2a (vildtype, sort linie) og Oct4GiP (grøn linje)-celler blev analyseret ved FACS. Histogram af GFP-kanal viser, at Oct4GiP celler er GFP-positive. B) Oct4GiP celler blev transficeret i 96-brønds plader med kontrol-eller Oct4-siRNA og FACS analyseret 4 dage efter transfektion. Fremad i forhold til side-scatter plot og histogrammer af GFP-kanal af de transficerede celler er vist. C) Oct4GiP celler blev transficeret med kontrol-, Nanog-, Oct4-eller Sox2-siRNA. De% Differentierede celler blev bestemt ud fra% GFP-negative celler 4 dage efter transfektion og blev afbildet som middelværdi + / - standard error af middelværdien (n = 4).f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovenfor kan kvantitativt måle omfanget af selvfornyelse vs differentiering. Sammenlignet med andre tilgængelige metoder, såsom morfologi-baserede 12 og proliferation / levedygtighed-baserede assays, giver det højere følsomhed og gennemløb, såvel som en mere direkte måling af ES-celle tilstand. Det er derfor velegnet til store skærme og genetiske epistasis analyse. Faktisk har vi og andre med succes brugt Oct4GiP reporter analysen for genom-dækkende RNAi skærme 3,8. Som alle assays er det imidlertid også begrænsninger. Det kan kun anvendes til at studere gener, der direkte eller indirekte regulerer Oct4 promotoraktivitet, og det kan fejlagtigt at identificere gener, som påvirker GFP-ekspression, stabilitet eller post-transkriptionelt. Derfor yderligere assays eller sekundære screeninger, såsom alkalisk phosphatase farvning 13 (Millipore, SCR004) og immunofluorescens-farvning eller kvantitativ RT-PCR af pluripotency markører 3,8,12,14 er forpligtet til at bekræfte resultaterne af denne metode.
Den Oct4GiP reporter-assayet er baseret på en effektiv gen-nedregulering. Effektive siRNAs og effektive siRNA transfektioner er nøglen til succes for analysen. Selvom vi kun beskrevet anvendelsen af reporter-assay med siRNA transfektioner, kan assayet også udføres med DNA-transfektioner til tavshed eller overudtrykke gener af interesse. DNA transfektionseffektivitet er sædvanligvis lavere end siRNAs og kan reducere styrken af fænotype.
Udover hvad der blev beskrevet i denne protokol, kan den Oct4GiP reporter analysen ændres for at identificere og karakterisere gener, der negativt regulerer selvfornyelse så godt. I dette tilfælde kan cellerne transficeres med siRNAs og dyrket i differentiering betingelser. Undertrykkelse af negative regulatorer af selvfornyelse vil forbedre selvfornyelse og opretholde GFP udtryk, som kan være detected af FACS på samme måde som beskrevet i den aktuelle protokol.
Udover de Oct4GiP reporter cellerne, har andre reportermolekyler cellelinier med ES-celle specifikke promotorer, såsom Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) og Rex1-GFP 19 celler, også blevet genereret. De kan også anvendes til at studere ES-celle selvfornyelse og vedligeholdelse anvendelse af den samme strategi. Men fordi der er mærkbar forskel i aktiviteten og specificiteten af disse ES-celle markørgenprodukter initiativtagere, disse reporter cellelinjer opfører sig forskelligt med hensyn til baggrunden niveau og følsomhed og vil derfor supplere hinanden. Endelig, ved hjælp af andre slægt-specifikke reporter ES-cellelinier, kan strategien modificeres til at studere skæbne-specifikation af ES-celler og lette anvendelse af ES-celle som en in vitro model for pattedyr tidlig udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Brad Lackford til læsning og redigering af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Egne Research Program Z01ES102745 (til GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
