Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer
Summary
We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische (<em> E. coli</em>) Systeem, wanneer ze in (of gefuseerd met de C-terminus) van vrijwel elke eiwit.
Abstract
Uitgebreid onderzoek heeft voldoende bewijzen waaruit blijkt dat het vouwen van eiwitten in de cel is een co-translationeel proces 1-5. Echter, de exacte pad dat polypeptideketen volgt tijdens de co-translationele vouwen om de functionele vorm te komen is nog steeds een raadsel. Om dit te begrijpen en de exacte conformatie van het co-translationele vouwen tussenproducten bepalen, is het noodzakelijk dat technieken dat de isolatie van RNC die beginnende ketens van voorafbepaalde afmetingen hun verdere structurele analyse mogelijk maken.
SecM (secretie monitor) is een 170 aminozuur E. coli-eiwit dat de expressie van de downstream SecA (secretie rijden) ATPase in de secM-seca operon 6 regelt. Nakatogawa Ito oorspronkelijk gevonden dat de 17 aminozuur lange sequentie (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) in de C-terminale gebied van het eiwit SecM nodig en voldoende omleiden tot blokkering van SecM rek bij Gly165, waardoor de productie van peptidyl-glycyl-tRNA stabiel gebonden aan de ribosomale P-site 7-9. Nog belangrijker is vastgesteld dat deze 17 aminozuur lange sequentie kan worden gefuseerd met de C-terminus van vrijwel volledige lengte en / of afgeknotte proteïne waardoor de produktie van RNC die beginnende ketens voorafbepaalde afmetingen 7. Dus, wanneer samengesmolten of ingevoegd in het doeleiwit, SecM blokkering sequentie produceert arrestatie van de polypeptideketen rek stabiel genereerd RNC zowel in vivo in E. coli-cellen en in vitro in een celvrij systeem. Sucrose gradiëntcentrifugering verder benut RNC isoleren.
De geïsoleerde RNC's kan worden gebruikt om structurele en functionele eigenschappen van de co-translationele vouwen tussenproducten te analyseren. Recent is deze techniek met succes gebruikt om inzicht te krijgen in de structuur van de verschillende ribosoom gebonden ontluikende kettingen 10,11. Hier beschrijven we de isolatie van runderen Gamma-B-crystalline RNC gefuseerd met SecM en genereerde in een in vitro translatie-systeem.
Protocol
Discussion
Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie cruciale zijn. Wij hebben in de handel verkrijgbaar in vitro transcriptie en translatie extracten en geven efficiënte en reproduceerbare resultaten indien zorgvuldig behandeld. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de integriteit van mRNA te testen alvorens het te gebruiken voor in vitro vertaling. Incubatietijd in v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 .
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
