Utilisation de la séquence d'arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound
Summary
Nous décrivons ici une technique qui est maintenant couramment utilisé pour isoler de manière stable liés ribosome complexes de la chaîne naissante (RNC). Cette technique tire parti de la découverte que de 17 acides aminés de long "séquence d'arrêt" SecM peut arrêter élongation de la traduction dans un procaryote (<em> E. coli</em>) Du système, lorsqu'il est inséré dans (ou fusionné à l'extrémité C-terminale) de pratiquement toute la protéine.
Abstract
Des recherches approfondies ont fourni des preuves suffisantes indiquant que repliement des protéines dans la cellule est un processus de co-traductionnelle 1-5. Toutefois, la voie exacte que la chaîne polypeptide suit au cours de co-traductionnelle de pliage pour réaliser sa forme fonctionnelle est encore une énigme. Afin de comprendre ce processus et de déterminer la conformation exacte des intermédiaires co-traductionnelles de pliage, il est essentiel de développer des techniques qui permettent l'isolement des porteurs de chaînes naissantes RNC de tailles prédéterminées afin de permettre leur analyse ultérieure structurelle.
SecM (moniteur sécrétion) est un acide aminé 170 E. protéines coli qui régule l'expression de l'aval Seca (conduite sécrétion) ATPase dans l'opéron SECM-secA 6. Nakatogawa et Ito initialement que une séquence de 17 acides aminés de longueur (G 150-FSTPVWISQA QGIRA P-166) dans la région C-terminale de la protéine SecM est nécessaire et suffisant pourprovoquer de décrochage de l'allongement SecM à Gly165, produisant ainsi peptidyl-glycyl-ARNt stable lié à la ribosomal P place 7-9. Plus important encore, il a été constaté que cette séquence de 17 acides aminés de long peut être fusionné à l'extrémité C-terminale de pratiquement n'importe quelle protéine de pleine longueur et / ou tronquée permettant ainsi la production de RNC porteurs de chaînes naissantes de tailles prédéterminées 7. Ainsi, lorsqu'il est fondu ou est insérée dans la protéine cible, la séquence de décrochage SecM produit arrêt de l'allongement de la chaîne polypeptidique et génère RNC stables in vivo dans E. coli et les cellules in vitro dans un système acellulaire. Centrifugation en gradient de saccharose est en outre utilisé pour isoler RNC.
Les RNC isolés peuvent être utilisés pour analyser les caractéristiques structurales et fonctionnelles des intermédiaires co-traductionnelles de pliage. Récemment, cette technique a été utilisée avec succès pour mieux comprendre la structure de plusieurs chaînes de ribosomes liés naissantes 10,11. Ici on décrit l'isolement de bovin gamma-B cristallin fusionné à RNC SecM et généré dans un système de traduction in vitro.
Protocol
Discussion
Pour obtenir des résultats reproductibles, la qualité et la concentration des composants utilisés pour la transcription in vitro et la traduction sont essentielles. Nous avons utilisé commercialement disponibles dans la transcription in vitro et des extraits de la traduction et elles donnent des résultats efficaces et reproductibles, s'il est manipulé avec soin. Qualité de l'ARNm peut affecter la traduction, de sorte qu'il est d'une importance capitale pour test…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par Human Frontier Science Program de subvention RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
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