Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak
Summary
Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır (<em> E. coli</em> Hemen hemen herhangi bir proteinin (ya da C-terminali ile kaynaşmış) içine yerleştirilir) sistem.
Abstract
Kapsamlı araştırma hücrede protein katlanması eş öteleme işlemi 1-5 olduğunu düşündüren yeterli kanıt sağlamıştır. Ancak, polipeptid zinciri işlevsel formunu elde etmek için işbirliği translasyonal katlama sırasında izlediği kesin yolu hala bir muammadır. Bu proses anlamak ve co-translasyon katlama aramaddelerinin tam konformasyon belirlemek amacıyla, bu da daha fazla yapısal analizi izin vermek için önceden belirlenmiş bir büyüklükteki olgunlaşmamış zincirler taşıyan RNCs izolasyonu izin teknikleri geliştirmek için gereklidir.
SECM (sekresyon monitör) 170 amino asit olan E. SECM-seca operon 6 içerisinde aşağı SecA (salgılanması sürüş) ATPase ekspresyon düzenleyen coli proteini. Nakatogawa ve Ito başlangıçta SECM proteininin C-ucu bölgesi içinde bir 17 amino asit sekansı, uzun (150-FSTPVWISQA QGIRA g p-166) için yeterli ve gerekli olduğu bulunduböylece peptidil-glisil-tRNA stabil 7-9 P-site ribozomal bağlı üreten, Gly165 az SECM uzama durmasına neden olur. Daha da önemlisi, bu 17 amino asit sekansı, uzun, böylece önceden belirlenmiş boyutlardaki 7 olgunlaşmamış zincirler taşıyan RNCs üretimini sağlayan hemen hemen herhangi bir tam uzunlukta ve / veya kesilmiş proteininin C-ucu oluşturacak şekilde eklenebilir olduğu bulunmuştur. Böylece, hedef proteinin içine kaynaşmış ya takıldığında, SECM durdurduklarını sekansı polipeptid zinciri uzama durması üretir ve E. in vivo hem de istikrarlı RNCs üretir coli hücreleri ve hücre içermeyen sisteminde in vitro. Sakkaroz degrade santrifüj daha RNCs izole etmek için kullanılır.
İzole RNCs co-translasyon katlama aramaddelerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri analiz etmek için kullanılabilir. Son zamanlarda, bu tekniğin başarılı birçok ribozom bağlı doğmakta zincirleri 10,11 yapısı içgörü kazanmak için kullanılmıştır. Burada sığır Gamma-B kristalen izolasyonu tarif SECM için erimiş ve in vitro çeviri sistemi bir oluşturulur RNCs.
Protocol
Discussion
In vitro transkripsiyonu ve çeviri için kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Biz in vitro transkripsiyon ve çeviri özleri içinde piyasaya kullanmış ve dikkatli eğer onlar, verimli ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri için kullanmadan önce mRNA bütünlüğünü test etmek için büyük önem taşımaktadır. In vitro çeviri için inkübas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0024 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 .
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
