Summary
Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van muizen. Cellen zijn geconcentreerd in pellets in de finale slangen worden gebruikt voor het transplanteren van de cellen onder de nier capsule. Het gemak van deze techniek vermindert de belasting van de cellen en de muis.
Abstract
Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van diabetische of normale muizen. We vonden dat het gemakkelijker was om de eilandjes of cellen te concentreren in pellets in de laatste aflevering buis (PE50) gebruikt om de cellen onder de nier capsule transplantatie. Deze techniek biedt zowel snelheid en het gemak terwijl het verminderen van onnodige spanning op de cellen of met de muis.
Laden: afgewikkeld, met de hand geplukt, eilandjes of gepelletiseerd cellen worden zorgvuldig opgezogen uit de bodem van een 1,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een P200 pipetteman en een rechte, dunne wand pipetpunt. Een lengte van PE50 slang is verbonden met de pipetpunt met een kleine adapter siliconen slang. Cellen zijn toegestaan, vestigen in de top, en vervolgens worden overgebracht naar de PE50 slang door langzaam het kiezen van het pipetteman. Nadat de cellen zijn in de buurt aan het einde van de PE50 slang, is een knik gemaakt en de siliconen adapter slang geplaatst over de knik. De PE50 slangen zijn overgebracht naar een 15 ml conische met een cut 5 ml pipet, en de PE50 slang geplakt over de rand van de 5 ml pipet om te voorkomen dat krullen tijdens het centrifugeren. Cellen zijn toegestaan om 1.000 tpm te bereiken en gestopt.
Transplantatie: Ontvanger muizen zijn verdoofd, geschoren en gereinigd. Een kleine incisie wordt gemaakt op de linkerflank van de muis en de nieren wordt blootgesteld. De nier, vet en weefsel worden vochtig gehouden met een fysiologische zoutoplossing wattenstaafje. Het distale uiteinde van de PE50 is bevestigd aan een Hamilton schroefaandrijving spuit met een pipet tip, met behulp van de siliconen-adapter slang. Een kleine nick wordt gemaakt op de rechterflank kant van de nier, niet te groot of te diep. De schuine uiteinde van de buis PE50, het dichtst bij de cellen, zorgvuldig onder de capsule, is de slang verplaatst voorzichtig om ruimte te maken, terwijl zwabberen fysiologische zoutoplossing, een droge capsule kan gemakkelijk scheuren. Een kleine luchtbel is geleverd onder de capsule door langzaam het kiezen van de spuit schroefaandrijving. Eilandjes worden dan langzaam geleverd achter de luchtbel. Zodra de eilandjes zijn geleverd nier homeostase wordt gehandhaafd en de knick is dichtgeschroeid met een laag vuur. De nier is terug geplaatst in de holte en het buikvlies en de huid worden gehecht en geniet. Muizen worden onmiddellijk behandeld met Flunixine en Buprenorfine ² en geplaatst in een kooi op een verwarmingselement.
Protocol
Voorbereiding van de Eilandjes voor transplantatie (Tx)
- Onder een omgekeerde microscoop, met de hand plukken eilandjes met behulp van een P200 Pipetman en recht pipet tip van de gekweekte eilandjes in een 100mm plaat.
- Count eilandjes 100 per keer en overdracht in elke microcentrifugebuis (~ 500 eilandjes / buis / muis).
- Laat eilandjes om zich te vestigen op de bodem van de microcentrifugebuizen.
- Teken een eilandje pellet in een P200 Pipetman (ingesteld op 130ul) met behulp van een rechte dunne wand pipet tip.
- Plaats een siliconen tube aan over de spuit. Plaats een lengte van PE50 slang in de siliconen adapter.
- Hang de Pipetman aan de zijkant van de kap en de tape van de PE50 slang aan op de kap muur hoger is dan de eilandjes in de punt. Hierdoor kan de eilandjes om zich te vestigen alleen in de punt van de pipet.
- Breng de eilandjes in de PE50 slang door langzaam het kiezen van de Pipetman en het verplaatsen van de eilandjes in de PE50 leidingen, zorg dat u de eilandjes te verdrijven uit het einde.
- Maak een knik in de schuine uiteinde van de buis PE50. Met behoud van de knik, koppel de adapter siliconen slang van de Pipetman en zet de knik met de siliconen adapter.
- Plaats de eilandjes in de PE50 leidingen, knikken silicone adapter buis naar beneden, in een 15 ml conische met een cut 5 ml pipet en tape de PE50 buis over de rand van de 5 ml pipet om te voorkomen dat krullen van de PE50 buis tijdens het centrifugeren.
- Centrifugeer de PE50/15mL conicals tot 1000 toeren per minuut en zet centrifuge. (Nooit meer dan 10 eilandjes van Langerhans voorbereidingen voor te bereiden in een keer).
- Plaats buis op ijs.
Voorbereiding van de Muis voor Transplant
- Verdoven van de muizen met isofluorane of met ketamine / Xylexene (zie voorbereiding protocol).
- Na verdoving heeft invloed, scheren de linker flank van de muis.
- Uitstrijkje huid van de muis, in het midden-out, met povidonjood wattenstaafje en veeg af met een EtOH wattenstaafje.
- Zoek de linker nier (net rechts van de milt). Maak een kleine incisie in de huid, het blootstellen van het buikvlies.
- Maak een kleine incisie in het buikvlies het blootstellen van de nier. Het houden van de incisie kleine zal helpen bij het houden van de nier en verhoogde blootgesteld.
- Breng een lichte druk aan beide zijden van de incisie, verhogen of pop uit de nier van de muis.
- Houd de nier vochtig door het toepassen van een fysiologische zoutoplossing met een katoenen wattenstaafje getipt.
- Behulp van een injectiespuit 23 of 25 gauge naald, een kleine kras op de rechterflank van de nier, het creëren van een inkeping in de nier capsule, niet te diep of te groot.
Transplantatie van eilandjes
Opmerking: Als de muis wordt voorbereid voor Tx, de tweede persoon moet de Hamilton schroef-drive eilandje transplantatie spuit voor te bereiden.
- Verwijder langzaam de siliconen adapter slang van de PE50 buis terwijl de knik in de slang.
- Plaats het andere uiteinde van de slang in PE50 de siliconen adapter slang en plaats de adapter siliconen slangen op de pipettip aan de "schroef-drive" glazen Hamilton spuit. Langzaam los van de knik in de PE50 leidingen en zorg ervoor dat de eilanden niet uitlekken.
- Langzaam vooruit de eilandjes aan het uiteinde van de slang PE50 behulp van de "schroef"-mechanisme, maar houd een kleine luchtbel in de voorkant van de eilandjes in de PE50 slang.
- In de nick in de nier, schuif de PE50 leidingen onder de capsule, het maken van een kleine pocket. Wees heel voorzichtig dat u de nieren of aanprikken door de capsule guts.
- Het helpt om het gebied en capsule vochtig te houden met een fysiologische zoutoplossing-Gentamycine gedrenkte katoenen getipt wattenstaafje, een droge capsule zullen gemakkelijk scheuren.
- Beweeg de slang in alle richtingen, het creëren van een "pocket" voor de getransplanteerde eilandjes om te rusten. Vergeet niet om bijkomende fysiologische zoutoplossing opnieuw te houden op het gebied vochtig.
- Onder leiding van de persoon die heeft geopend met de muis en die plaatste de PE50 leidingen onder de nier capsule, de tweede persoon, die bereid zijn de muis en Hamilton transplantatie spuit, zal langzaam vooruit eilandjes onder de capsule, in de "pocket", achter een kleine luchtbel afgeleverd door de PE50 leidingen, worden totdat alle eilandjes getransplanteerd.
- Verwijder langzaam de PE50 slangen, droog het gebied met een droog wattenstaafje en zorgvuldig de nick cauterize met een laag vuur.
- Met behulp van een droge katoenen wattenstaafje tip, zorg ervoor dat alle bloeden is gestopt. Zodra bloeden is gestopt, opnieuw bevochtigen van de nier met een steriele zoutoplossing, en voorzichtig de nier voorafgaande vervangen in het buikvlies aan het sluiten van de muis met hechting en de huid nietjes.
Sluiting / Revival van de muis
- Sluit het buikvlies met een rijgsteek met 5-0 zijde hechtingen w / een C-6 19mm naald.
- Met behulp van een tang samen te trekken beide zijden van de huid incisie.
- Nieten van de huid, samen met 2 of 3 nietjes.
- Reinig de huid van de muis van een bloed, met behulp van een katoenen getipte wattenstaafje en Saline.
- Onmiddellijk te behandelen van de muis met een subcutane injectie van Flunixine en buprenorfine.
- Plaats de muis in een kooi, dat wordt geplaatst op een verwarmingselement of onder een warmtelamp, totdat de muis is volledig actief.
- Verwijder de huid nietjes in 2 weken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een praktische en efficiënte optie voor zuiver en eenvoudig het leveren van eilandjes of cellen onder de nier capsule van diabetische of normale muizen. De techniek van het concentreren en pelleteren de eilandjes of cellen in de uiteindelijke levering buis (PE50) gebruikt om de cellen te transplanteren in de nier capsule biedt een eenvoudige en effectieve methode van het transplanteren van cellen terwijl het verminderen van onnodige spanning op de cellen of met de muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc Johnson & Johnson Company.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
