El trasplante de islotes pancreáticos en la cápsula renal de ratones diabéticos
Summary
El protocolo fue desarrollado para ofrecer de forma limpia y fácil de islotes o células bajo la cápsula renal de ratones. Las células se concentran en pastillas en el tubo final utilizado para trasplantar las células en la cápsula renal. La facilidad de esta técnica reduce el estrés de las células y el ratón.
Abstract
El protocolo fue desarrollado para ofrecer de forma limpia y fácil de islotes o células bajo la cápsula renal de ratones diabéticos o normal. Se encontró que era más fácil concentrarse los islotes o células en pastillas en el tubo de distribución final (PE50) utilizados para el trasplante de las células en la cápsula renal. Esta técnica ofrece la velocidad y la facilidad y reducir cualquier tensión indebida a las células o el ratón.
Cargando: Colocado, recogido a mano, los islotes o células sedimentadas son cuidadosamente aspiración de la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con un pipetteman p200 y una escalera, de pared delgada punta de la pipeta. Una longitud de tubería PE50 está conectado a la punta de la pipeta con un tubo de silicona pequeño adaptador. Las células se deja reposar en la punta, y luego se transfieren a la tubería PE50 lentamente marcando el pipetteman. Una vez que las células se encuentran cerca del extremo de la tubería PE50, una torcedura se hace y el tubo adaptador de silicona se coloca sobre la torcedura. La tubería PE50 se transfiere a un cónico de 15 ml que contiene una pipeta de corte de 5 ml, y la tubería PE50 se pega por el lado de la pipeta de 5 ml para evitar curling durante la centrifugación. Las células pueden llegar a 1.000 rpm y se detuvo.
Trasplante: ratones receptores son anestesiados, afeitado y limpio. Una pequeña incisión en el flanco izquierdo del ratón y el riñón está expuesto. Los riñones, la grasa y el tejido se mantiene húmeda con hisopo de solución salina normal. El extremo distal de la PE50 está conectado a una jeringa Hamilton tornillo disco, que contiene una punta de la pipeta, utilizando el adaptador de tubo de silicona. Una pequeña incisión se hace en el lado del flanco derecho de los riñones, no demasiado grande ni demasiado profunda. El extremo biselado de la tubería PE50, la más cercana a las células, se coloca cuidadosamente debajo de la cápsula, el tubo se mueve alrededor con cuidado para hacer el espacio mientras la limpia solución salina normal, una cápsula seca puede romper fácilmente. Una pequeña burbuja de aire se entrega bajo la cápsula lentamente marcando el husillo de la jeringa. Los islotes son entregados luego, lentamente, detrás de la burbuja de aire. Una vez que la homeostasis de los islotes se han entregado los riñones se mantiene y los chismes se cauteriza con fuego lento. El riñón se coloca en la cavidad y el peritoneo y la piel son suturados y engrapados. Los ratones son inmediatamente tratados con buprenorfina flunixino y cuadrados y se coloca en una jaula en una almohadilla eléctrica.
Protocol
Discussion
Este protocolo proporciona una opción práctica y eficiente de limpia y fácilmente la entrega de los islotes o células bajo la cápsula renal de ratones diabéticos o normal. La técnica de la concentración y peletización de los islotes o células en el tubo de distribución final (PE50) utilizado para trasplante de las células en la cápsula renal ofrece un método fácil y eficaz de trasplante de células, mientras que la reducción de cualquier exceso de estrés a las células o el ratón.
Acknowledgements
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC islote central. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson Company.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Surgical gloves | Fisher | 11-394-95(sz) | ||
| Surgical scrub sponges | Moore medical | 42940AK | ||
| Forceps | Miltex | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight | |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex | 5-290 | ||
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher | 01-305-10B | ||
| 4×4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | ||
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | ||
| Alcohol pads | Fisher | 14-819-2 | ||
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | ||
| 23G or 25G needles | 1″ long | |||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments | |
| PE50 polyethylene tubing | BD | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. | |
| Cidex + 28 day soln | Moore | 35625AK | ||
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID | |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | ||
| Straight Pipet Tips | TipOne | 1111-0810 | sterile | |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton | 1001 | ||
| Cauterizing tool | Roboz | RS230 | ||
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | ||
| 5-0 silk | Look | 754B | for suture (6-C) | |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | |||
| 9mm autoclip stapler | BD | 7630 | ||
| 9mm staples | BD | 7631 | ||
| 9mm staple remover | BD | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
