تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان
Summary
هذا الفيديو يشرح الإجراءات اللازمة لتوصيف البنكرياس الجزر الإنسان باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) والمناعية (IHC). وملطخة أقسام البنكرياس من الرأس والجسم، ومنطقة الذيل من جانب كل من H & E وIHC لتحديد جزيرة تكوين الغدد الصماء (الأنسولين، الجلوكاجون، والبنكرياس ببتيد)، والنسخ الخلية (Ki67)، وتتسرب التهابات (H & E، CD3). يكون موضعيا في المنطقة الكلابي باستخدام IHC للببتيد البنكرياس.
Abstract
تقديرات لمنطقة جزيرة وأرقام والغدد الصماء في البنكرياس تكوين الخلية البشرية الكبار تختلف من مائة ألف إلى عدة نطاقات الشامل عدة ملايين وبيتا من 500 إلى 1-3 ملغ 1500. مع هذا التباين المعروفة، وقد وضعت لتجهيز قياسي، وتلطيخ الاجراء بحيث حددت بوضوح مناطق البنكرياس والجزر تتميز باستخدام التشريح المرضي الدقيق والفحص immunolocalization.
وصفت إجراءات موحدة لمعالجة البنكرياس الإنسان تعافى من المتبرعين في الجزء 1 من هذه السلسلة. تتم معالجة البنكرياس إلى 3 مناطق رئيسية (رأس والجسم، والذيل)، يليه قطاعات عرضية. وتنقسم مزيد من المقاطع العرضية من رأس البنكرياس، كما هو مبين على أساس الحجم، ومرقمة حسب الترتيب الأبجدي للدلالة على الفروع. هذا التوحيد القياسي يسمح للتحليل كامل المقطعية في المنطقة بما في ذلك منطقة رأس الكلابي الذي يحتوي على الجزر تتكونفي المقام الأول من خلايا البنكرياس ببتيد للمنطقة الذيل.
التقرير الحالي يضم الجزء 2 من هذه السلسلة، ويصف الإجراءات المستخدمة لباجتزاء مسلسل وتوصيف الأنسجة من المقاطع البارافين البنكرياس مع التركيز على خلايا الغدد الصماء جزيرة، والنسخ، وتتسرب تي خلية. ويهدف علم الأمراض من الأقسام البنكرياس لتوصيف كل من إفرازات، ductular، ومكونات الغدد الصماء. يتم تقييم مقصورة الاكسوكرين عن وجود التهاب البنكرياس (النشطة أو المزمنة)، وضمور، والتليف، والدهون، فضلا عن نظام لاصق، وخصوصا في العلاقة مع وجود ورم البنكرياس ينترادوكتال 4. يتم تقييم الجزر لمورفولوجيا والحجم والكثافة، وخلايا الغدد الصماء، والتهاب، والتليف، اميلويد، ووجود خلايا تكرار أو أفكارك باستخدام H & E والبقع IHC.
العنصر الأخير هو موضح في الجزء 2 هو توفير الشريحة الملونالصورة الرقمية والصور الشريحة بأكملها. ويتم تنظيم الشرائح الرقمية على حدة والمنطقة البنكرياس في قاعدة بيانات على الانترنت علم الأمراض إنشاء البنك الحيوي الظاهري. ويجري حاليا توفير إمكانية الوصول إلى هذه المجموعة على الانترنت لأكثر من 200 الأطباء والعلماء المشاركين في البحث السكري من النوع 1. قاعدة البيانات على الانترنت يوفر وسيلة لتبادل البيانات السريع والكامل، وعلى المحققين تحديد كتل لالبارافين أو مقاطع المسلسل المجمدة.
Protocol
Discussion
توحيد الإجراءات IHC أمر حاسم بالنسبة لتحليل الصور، وخاصة عندما تستخدم الكمبيوتر المستندة إلى خوارزميات عبر عدد كبير من الشرائح مع مرور الوقت. والإجراء تلطيخ IHC المبينة في هذا التقرير تسمح تحليل مجموعة من العينات للمانحين نظرا لاستخدام autostainer ضمن يوم العمل 8 ساعات ويتم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفان بالشكر عائلات المانحين والمنظمات الحصول على الأعضاء المشاركين في هذا البحث ومونتغومري إيميلي، Pietras روبرت، فو آن، أغاروال ميتالى، وأغاروال روشان للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث السكري الأحداث (MC-T.) لدعم الشبكة للمتبرعين بالأعضاء البنكرياس مع مرض السكري.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
- In’t Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n. ‘. t., P, . Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).
